脑卒中后抑郁中医病证结合动物模型的思考

邵乐，焦欣，刘林，佘颜*

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

脑卒中是严重危害人类生命健康的重大心脑血管疾病之一，数据表明，全世界每年新增脑卒中患者约1 690万人[1]。脑卒中患者极易并发抑郁症，也是脑卒中后最常见的并发症。脑卒中后抑郁(post-stroke-depression，PSD)属于中医中风合并郁证的范畴，其发病率高达38%，抑郁使得脑卒中患者存活率下降51%，为影响患者康复、甚至轻生的第一大元凶，是全球面临的一大难题[2]。中医药通过辨证论治，采用中药复方可多成分多途径多靶点治疗PSD，而建立与临床中医辨证分型相符的PSD动物模型对于开展其基础研究具有重要意义。目前PSD造模为采用脑卒中模型复合抑郁模型而成，现将PSD中医病证结合动物模型的造模方法和相关思考阐述如下。

1 实验动物

目前PSD模型的动物造模主要采用大鼠及小鼠，常用Wistar大鼠[3-4]、Sprague-Dawley大鼠[5]及C57BL/6J小鼠[6-7]、balb/c小鼠[8]，ICR小鼠[9]、Laca小鼠[10]，其中SD大鼠和C57BL/6J小鼠在PSD模型造模中最为普遍，其中Wistar大鼠对应激敏感[11]，SD大鼠具有遗传抑郁[12]。雌激素对脑血管具有保护作用[13]，故较少使用雌性动物而多采用雄性动物。

2 脑卒中中医病证结合模型

2.1 气虚血瘀证

气虚血瘀为缺血性脑卒中的基本病机，“气为血之帅，血为气之母”，气虚则无力推动血液运行，导致血瘀出现，气虚日久，必然导致血瘀出现，王键[14]等根据中医“人过四十，阴气自半”“饥则损气”“胃不和则卧不安”“劳则耗气”“湿伤脾，寒伤肾”“忧思伤脾，惊恐伤肾”“肥甘厚味易致高粱之疾”理论，采用“游泳+饥饿+寒湿+中年+高脂饮食”模拟气虚血瘀模型后行动脉夹夹闭双侧颈总动脉，3h后松开恢复血流。刘超明[15]等根据“劳则气耗”中医理论，采用持续力竭性游泳法，气耗日久必气虚，气虚则行血之力不足，血行渐缓久之成瘀，再合并大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注(MCAO-R)模型制成脑卒中气虚血瘀型证大鼠模型。谭辉[16]等根据“气为血之帅”理论，结合低氧环境模拟不能吸入足够“自然界清气”，宗气不能生成，采用饥饿、疲劳、低氧、肥甘厚味因素模拟气虚血瘀证合并线栓法制作MCAO-R气虚血瘀大鼠模型。王健[17]等运用大黄泻下法合并MCAO建立气虚血瘀证脑缺血再灌注大鼠模型。模型评价指标[18]以大鼠脑缺血表现及体征为精神萎靡，双眼浅红、微睁、无神，自主活动少，外界刺激反应迟钝，舌质呈暗紫色、毛发粗糙易掉等症状即造模成功。

2.2 肾虚证

肾为先天之本，肾藏精，上通于脑，脑为髓海，“人始生成精，精成而脑髓生”，国内学者依据以上理论，建构肾虚型脑缺血大鼠模型。张雨薇等[19]根据缺血性脑血管病的发生与“肾精亏虚”密切相关，制备pMCAO大鼠模型后每日肌注氢化可的松注射液15 mg/kg制备肾阳虚脑缺血大鼠模型，造模评价指标以其除脑缺血症状外，出现活动减少、畏寒喜暖、弓背蜷缩、食欲降低、迟钝、四肢消瘦、脱毛、多尿及体质量降低等即为造模成功。刘宏等[20]根据“肾通于脑”及“恐伤肾”理论，在MCAO手术前，用“猫吓鼠”法，以活鼠喂猫示众，增加恐吓氛围，建立肾虚模型或采用双侧性腺摘除法制备肾虚模型，评价以方测证判断其为肾虚模型造模成功。

2.3 痰瘀互结证

脾为生痰之源，脾失健运，聚湿成痰，痰浊内生，痰瘀互结，壅滞经脉，上蒙清窍，发为中风。张令霖等[21]采用高脂饲料喂养结合大脑中动脉栓塞法制作痰瘀互结脑缺血再灌注大鼠模型，通过高脂、高糖、高蛋白饲料喂养，形成动脉粥样硬化病理特点模拟“痰”证，MCAO法模拟“瘀”证，评价以出现肢体偏瘫，眼睑下垂，舌苔厚腻，舌质紫暗等表现及血脂升高表明造模成功。刘抒雯等[22]采用脂肪乳剂灌胃合并线栓法制作痰瘀互结证脑缺血大鼠模型，以大鼠一般情况及血液流变学、血脂指标进行验证其造模成功。

2.4 火热证

火热证是《中风病辨证诊断标准》依据中风病临床症状量化诊断研究分出的风证、火热证、痰湿证、血瘀证、气虚证及阴虚阳亢证六大证候之一，火毒证动物模型符合临床火热证型，采用腹腔注射角叉菜胶复合MCAO建立急性脑梗死火毒证大鼠模型[23-24]，以爪甲肿胀红紫、尾部血栓明显，出现黑尾现象、耳廓边缘发红、舌底脉络青紫粗长以及细络瘀血、肛温增高、体重无明显下降为火毒证模型纳入实验。瘀血阻络为脑缺血的根本病因，瘀热证亦属火热证，蒋宝平等[25]采用间隔24 h，分2次给予LPS，每次50 μg/kg，第二次给予LPS后2 h，再合并MCAO复制瘀热证，采用炎症因子及血液流变学的变化以验证模型。

3 抑郁中医病证结合模型

包祖晓[26]等采用注射利血平和氢化可的松建立肝肾阳虚型抑郁症病证结合模型，依据利血平为制作阳气亏虚证常用模型，糖皮质激素模型为制作肾阳虚证经典动物模型，且均可出现类似抑郁症病理变化制作肝肾阳虚型抑郁症模型。采用一般四诊指标及四诊计量化检测与计量辨证方法检测大鼠阳热、气虚、阴虚、血虚程度评价验证模型。

4 PSD造模方法及评价

PSD基本病因为“瘀”“郁”，其中医病证结合模型文献报道较少，可采用脑缺血中医病证模型合并抑郁模型制作而成，PSD造模多在脑缺血模型的基础上采用以下方法。

4.1 PSD造模方法

4.1.1 慢性温和不可预知应激(CUMS)合并孤养法

CUMS合并孤养法是目前国内外常用的PSD造模方法，CUMS模式作为经典的抑郁模型制备方法，可模仿临床病人在日常生活中遇到的物理生理刺激，导致其快感缺失以及对各种外界刺激反应降低等核心症状，其具有高度有效性、稳定性，基本符合抑郁模型要求，但造模过程较为复杂，工作量较大。主要采取禁食24 h，禁饮18～24 h，昼夜颠倒、冰水游泳(4 ℃，5～6 min)，夹尾(1～2 min)，笼倾斜(40°～45°，15～24 h)等[27]。孤养法采用单笼饲养，其模拟抑郁性障碍的孤独，社会隔离，社会交往减少及异常。

4.1.2 束缚应激法

在脑卒中术后1周，将动物置于体积限制、通风良好的圆柱体塑料管内，或将大鼠限制在束缚架上，2 h 1次/d，持续1～2周，予以每日2 h的行为限制，其通过严格限制动物活动而诱发类似人类抑郁障碍的核心症状,属于不可逃避性或强制性心理应激模型[28]。

4.1.3 悬尾和强迫游泳实验

卒中造模后每天进行强迫游泳和悬尾应激，强迫游泳实验[29]：将动物放入一定水深的桶内，水温(25±2)℃。实验前预测6 min,选取静止不动时间70～160 s的动物实验用。游泳时间为6 min,累计后4 min内的不动时间。不动时间是指小鼠在水中停止挣扎,或呈漂浮状态,仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面的持续时间；悬尾实验[29]：将动物尾部距末端用夹子固定,倒悬于的箱内，悬挂时间为6 min,累计后4 min内的不动时间。其属于绝望模型，可诱导抑郁，亦可作为抑郁评价指标，造模方法简单，易于观察。

4.1.4 利血平法

卒中后合并孤养加利血平法法制备PSD模型，采用腹腔注射利血平0.2 mg/kg，每日1次，共14 d[30]。利血平可引起抑郁样症状，其造模时间短，机理明确，可使脑中生物胺(去甲肾上腺素、5-HT、多巴胺) 耗竭，诱导大鼠及小鼠体温降低、眼睑下垂、腹泻、运动能力下降等现象，抑郁药理学模型的首选，可用于药物筛选[31]。

4.2 PSD模型评价

4.2.1 神经功能评价

卒中后神经功能主要采用Longa 5分法[32]、Bederson5分法[33]等进行神经功能评价。Longa5分法：0分：没有神经功能损伤症状；1分：左侧肢体不能完全伸直；2分：行走不稳，向左侧打转；3分：站立不稳，行走时向左侧倾斜；4分：意识昏迷。Bederson5分法：0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向瘫痪侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

4.2.2 行为学评价

抑郁主要采用行为学检查，糖水偏好实验[34]检测其快感缺失情况，可作为抑郁评价的金标准。旷场实验、明暗穿梭实验及Morris水迷宫测定[35]验检模型动物的活动情况，可检测其焦虑样行为；强迫游泳实验及悬尾实验检测[29]动物绝望行为。具体方法如下：

①糖水偏好实验：每笼两瓶水，1瓶糖水，1瓶纯水，记录各自重量,24 h后再称量剩余水重量。计算糖水偏好指数：糖水消耗量/总液体消耗量×100%。

②旷场实验：将鼠置于场箱底面的中心，用实时视频图像跟踪分析系统记录鼠在3～5 min内的活动情况。测试安排在暗室中，每次测定结束将排泄物清除干净，每只仅测定1次。分析指标包括：移动距离、平均速度(不包含休息时间)。

③明暗穿梭实验：把鼠放进穿梭箱内的任何一个空间，先进行主动回避反应训练，20 s后开始出现灯光或和蜂鸣音，该刺激持续15 s，其中后10 s内再加上电刺激。最初动物只对电刺激出现反应，即逃至箱子对侧空间躲避电击。20 s后再次出现灯光或蜂鸣音，并同时在其所在侧施加电刺激，迫使其跳至另一侧，反复进行穿梭训练，出现主动回避反应。记录动物反应次数及受到刺激后穿梭到另一空间的时间。

④Morris水迷宫测定：适应性训练后，将鼠置于逃生平台，随后将其放入离平台最远象限，开始计时，直至鼠登上逃生平台后5 s停止计时，允许游泳时间为60 s。如此将鼠依次放入其余3个象限,分析指标包括：逃避潜伏期、轨迹(路径)、总路程、总时间、平均速度、搜索策略、各象限游泳路程等。

⑤强迫游泳实验及悬尾实验同4.1.3实验操作。

5 讨论

辨证论治是中医药临床治疗疾病的优势所在，而符合中医病证结合的动物模型是中医药进行基础研究的根本，其要求动物在复制疾病的模型时，必须考虑到相应的中医证型。

综上所述，目前PSD的造模以脑缺血模型复合抑郁模型而成，其中脑缺血病证结合模型以气虚血瘀证、肾虚证、痰瘀互结证、火热证最为常见，然而抑郁症病证结合模型研究较少。根据现有抑郁造模方法分析CUMS合并孤养法、束缚应激法、悬尾和强迫游泳实验均属于情志不良所致肝失疏泄之肝气郁结证，现代研究发现利血平法属于阳气亏虚证候类造模法，而中医内科学教材将郁证的辨证分为肝气郁结、气郁化火、血行郁滞、痰气郁结、心神惑乱、心脾两虚、心阴亏虚及肝阴亏虚，除肝气郁结证外，其余证型的抑郁中医病证结合模型研究少见。但是，采用脑卒中病证结合模型复合抑郁模型建立PSD病证结合模型后仍难以保证其证型一致，也很有可能会发生改变。故应在PSD疾病模型已建立的基础上复合中医证型造模，是获得PSD中医病证结合动物模型的有效途径，其具体研究方法还有待进一步探讨与验证。因此，建立稳定、可重复、操作简单的PSD中医病证结合动物模型是进行中医药防治PSD基础研究的当务之急，仍是广大中医药专家和学者研究的重中之重。