肠道菌群对肿瘤免疫治疗的影响

郑舒月，彭艳梅，张静怡，崔慧娟

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.北京中医药大学房山医院 肿瘤科，北京 102499；3.中日友好医院 中西医结合肿瘤内科，北京 100029）

肿瘤免疫治疗主要研究的是免疫检查点抑制剂（immune checkpoints inhibitors，ICIs）的应 用[1]，例如 针对细 胞毒性T 淋巴细胞抗原-4（cytotoxic T-lymphocyte antigen 4，CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein-1，PD-1）的单克隆抗体[2，3]。前瞻性试验和荟萃分析已经证实了ICIs 与化疗相比在患者中的疗效和安全性[4，5]。值得注意的是，一旦ICIs 发挥作用，它们就更有可能长期具有抗癌功能，有些人甚至可以完全治愈[6]。然而ICIs 在应用于患者机体治疗时的异质性却很高[7]，能够从免疫治疗中取得显著疗效的患者群体，仍在探索中。人体肠道中有多种微生物，数目超过机体自身细胞的10 倍。近年研究表明，肠道菌群可以影响肿瘤的免疫治疗结果[8，9]。临床前的基础研究提示，肠道微生物群可以通过与宿主免疫系统的相互作用调节PD-1 抑制剂治疗的反应[10]。因此，肠道菌群目前被认为是一个可能预测肿瘤免疫治疗效果的重要指标。

1 肠道菌群对免疫治疗的影响

1.1 相关机制的基础研究

2015年Sivan 等[11]注意到一些特殊共生细菌的丰富度与小鼠模型中PD-1 抑制剂的治疗效果相关。他们比较了相似遗传基因小鼠 （C57BL/6） 的在不同的肠道微生物群（JAX 和TAC） 中的PD-1 抑制剂治疗效果， 结果表明在JAX 种群中肿瘤生长较慢，对PD-1 抑制剂治疗更敏感。通过同居或移植JAX 粪悬液到TAC 小鼠体内， 他们发现这种差异是由于JAX 增强了抗肿瘤的免疫能力。16S rRNA测序技术进一步研究表明，JAX 中的双歧杆菌数量显著增加，进而导致肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）水平升高，最终使得PD-1 抑制剂治疗的疗效更好。Vétizou 等[12]发现一些特殊的肠道菌群补充剂可以增强CTLA-4 抑制剂的作用。他们同时注意到，广谱抗生素的治疗消除了CTLA-4 抑制剂的抗肿瘤作用，而且CTLA-4 抑制剂不能有效地抑制无菌小鼠的肿瘤进展， 这些都表明肠道菌群可能参与了CTLA-4 抑制剂的治疗。为了证实这一结论，他们又在无菌小鼠或抗生素治疗小鼠中移植了多形拟杆菌、脆弱拟杆菌或伯克霍尔德菌，最终解除了无菌小鼠对于CTLA-4 抑制剂的耐药。

这些基础研究表明肠道菌群中的部分种群可以提高PD-1 抑制剂和CTLA-4 抑制剂在肿瘤小鼠模型中的疗效，甚至解除耐药，值得在临床中进一步探索研究。

1.2 临床试验进展

Gopalakrishnan 等[13]分析了接受PD-1 抑制剂治疗的黑色素瘤患者的肠道微生物群。结果表明，应答者的肠道微生物多样性较高， 粪便样本的α-多样性与无进展生存率（progression-free survival，PFS）呈正相关。进一步细化分析表明，应答者体内的大肠杆菌水平较高，而非应答者体内的大肠埃希菌则显著富集。Matson 等[14]也注意到肠道菌群对转移性黑色素瘤患者PD-1 抑制剂治疗效果有影响。他们基于一种综合的分析方法（包括16S rRNA 测序、亚基因组鸟枪测序和物种特异性定量聚合酶链反应） 观察到，一些细菌，如双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜气性柯林斯菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯菌、乳酸杆菌属、拟杆菌科和微小埃洛内拉菌，在应答者中显著富集，而无应答者中则有大量的卵形瘤胃球菌和肠道罗斯拜瑞氏菌。Routy 等[15]报道了肠道菌群在PD-1 抑制剂耐药中的作用。他们发现，对于接受PD-1 抑制剂治疗的癌症患者， 口服抗生素治疗 （在PD-1 抑制剂治疗开始的前2 个月或开始后的1 个月内）会显著缩短总生存率（overall survival，OS）和PFS。他们进一步比较了应答者和无应答者之间肠道菌群组成上的差异，发现在应答者所有过度表达的细菌中，嗜酸阿克曼菌与患者的应答率最显著相关（P=0.007）。Chaput 等[16]验证了肠道菌群对转移性黑色素瘤患者CTLA-4 抑制剂治疗的调节作用。在招募的患者中，基线测量肠道菌群中含有过多类杆菌的患者预后不良（P=0.034），而肠道菌群中粪杆菌较多的患者则有长期的获益（P=0.0092）。此外，对存活时间超过18 个月的患者进行肠道菌群的分析发现， 它们含有大量的瘤胃球菌和漆球菌。聚类分析表明，肠道微生物群中含有粪杆菌或其他属于厚壁菌门类的细菌的患者往往具有更好的临床结果（PFS：P=0.039；OS：P=0.051）。

Jin 等[17]报道了接受Nivolumab 治疗的非小细胞肺癌患者的数据， 通过16S rRNA 基因测序分析患者治疗前后的粪便标本发现，肠道菌群多样性较高的患者比多样性较低的患者有较长的PFS。对Nivolumab 治疗的应答组和非应答组的粪便组成差异性分析表明， 应答组的Alistipes putredinis、长双歧杆菌和Prevotella copri 等细菌明显富集，而非应答组的瘤胃球菌则较多。Elkrief 等[18]发现，在免疫治疗前进行抗生素治疗， 是导致PFS 缩短的独立危险因素（HR=0.32，95%CI 0.13～0.83）。在免疫治疗前接受抗生素治疗的患者将会对免疫治疗的有效反应性降低（抗生素组与对照组的客观反应率分别为0%和34%），预后改善率下降 （抗生素组对比对照组的PFS=0.28，95%CI 0.10～0.76，P=0.01）。

这些研究所发现的有益肠道菌群的种群虽不完全相同，但可看出杆菌类的细菌，如双歧杆菌、大肠杆菌等，往往能够提高免疫治疗的效果。而且大多研究提示在免疫治疗的前期使用抗生素会降低免疫治疗的效果。

2 肠道菌群

2.1 肠道菌群的组成和功能

肠道菌群中含有大量的微生物，如细菌、真菌、原生动物、病毒、噬菌体和古细菌等[19]。一般认为肠道菌群由必需菌和机会菌组成[20]。必需菌对人体有益，参与发酵未消化的碳水化合物和内源性粘液，合成短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）和维生素，抵御病原体感染[21，22]。相反，机会性细菌的过度生长会导致感染[15]。必需细菌和机会性细菌之间的不平衡会导致肠道失调，这通常是指在环境或宿主相关因素的驱动下，微生物群的组成和功能的改变。

肠道的必需菌包括益生菌和共生菌，它们在肠道能够形成有重要功能的菌膜。正常情况下，肠道菌群表层的主要成分是大肠埃希菌、肠球菌，中层主要是以类杆菌为主的厌氧菌，深层则主要是乳酸杆菌和双歧杆菌。深层的菌群可以与肠黏膜上皮表面的特异性受体结合，形成可以抵御过路菌侵袭的生物屏障。双歧杆菌等益生菌对机体的发育、代谢、合成维生素和微量元素、免疫激活、抵御致病菌、参与肠肝循环、保护机体健康等起到举足轻重的作用[23]。

2.2 肠道菌群的测定方法

①分离培养，观察菌落数：方万红[24]在分析四磨汤对患儿肠道菌群平衡和消化功能的影响时通过观察菌落数，计算肠杆菌、葡萄球菌、乳酸杆菌、双岐杆菌菌落数作为评定肠道菌群功能的方法。常规的基于分离培养、观察菌落数的方法虽比较成熟，但是大多肠道菌群不能培养且比较耗时耗力。因此这种方法不能全面地分析种类和数量庞大的肠道微生物系统。②质谱分析技术：可以在复杂体系中同时区分不同组分的特点，能够快速、准确、高通量地鉴别不同的肠道菌群。③基因测序（16S rRNA 设计引物）：近年来，随着高通量测序技术的发展，16S rRNA 基因测序技术在细菌的鉴定与分类研究中发挥着越来越重要的作用。Matson 等[15]在研究肠道菌群对转移性黑色素瘤患者PD-1抑制剂治疗的影响时采用了综合的分析方法，其中就包括了16S rRNA 基因测序技术。Chaput 等[17]采用16S rRNA 基因测序来研究黑色素瘤患者的肠道菌群， 以预测ipilimumab 治疗疗效和结肠炎的发生率；Elkrief 等[18]在研究肠道菌群多样性对中国非小细胞肺癌 （non-small-cell lung cancer，NSCLC） 患者免疫治疗疗效时也采用了16S rRNA基因测序来评估大便标本中的肠道菌群谱。16S rRNA 基因普遍存在于细菌细胞，在细菌基因组中位于核糖体小亚基（约1540bp），该区域兼顾保守性和高变性，含有10 个保守区域 （Conserved Regions） 和9 个高变区域（Variable Regions），保守区可用于设计引物进行目的片段的扩增，而通过对高变区的分析可以辨别细菌种类。因此，16S rRNA基因被认为是最适于细菌系统发育学的研究和物种分类鉴 定[25，26]。

所以当粗略估测肠道菌群部分常见成分的数量变化多采用观察菌落数的方法，而精准分析肠道菌群成分变化还是需要依赖16S rRNA 设计引物的高通量测序。

3 总结与讨论

目前，免疫治疗已逐渐成为肿瘤治疗的主流。抗肿瘤的免疫过程是用一个称为“肿瘤免疫周期”的模型来描述的。首先由肿瘤源性的抗原启动免疫反应，之后抗原提呈细胞会捕获和呈递肿瘤抗原，接着在外周淋巴器官中的原始T 细胞就会被启动和激活。然后，激活的T 细胞迁移、浸润、杀死肿瘤细胞。所以抗肿瘤的免疫疗法本质上是通过机体自身的免疫系统杀死肿瘤细胞[27]。

而肠道菌群可以调节多种免疫效应物，尤其是树突细胞（dendritic cell，DC）。DC 作为抗原提呈和T 细胞活化的核心，是免疫监视和免疫清除的决定性因素。一些细菌如双歧杆菌可以通过促进DC 成熟、 上调细胞因子分泌、以及促进肿瘤特异性T 细胞的活化来增强DC 的功能[24]。所以肠道菌群对宿主的免疫应答有重要的影响，它们可以协同调节肿瘤免疫周期的多个步骤。目前认为在肿瘤的免疫治疗中，调控肠道菌群可以诱导形成系统免疫，进而提高疗效，克服耐药性。同时部分临床证据表明，免疫治疗前后使用抗生素会降低免疫治疗的效果。

当前对肠道菌群和肿瘤的免疫治疗还存在一些问题：①各临床试验中发现的有益于免疫治疗的肠道菌群并不完全相同；②肠道菌群在肿瘤免疫周期中的作用机制还有待进一步研究探讨；③目前虽然已有不少临床试验研究肠道菌群对免疫治疗的影响，但是样本量较小，部分属于回顾性研究，证据级别不高，需要更多前瞻性的研究；④使用抗生素是否影响免疫治疗的效果仍存在争议。所以，期待能够开展更多的基础和临床研究来探索出有益的肠道菌群，选出免疫治疗有效的患者群，进而通过菌群移植等方式提高免疫治疗效果，使患者得到更长的生存期。