葛瑞林对脓毒症致急性肺损伤小鼠炎症反应的效果及机制研究

周 虹，崔 娟，陆 尤，孙 晶，孙力超，李 彦★

（1.应急总医院 急诊科，北京 100028；2.应急总医院 药学部，北京 100028；3.中日友好医院 急诊科，北京 100029）

脓毒症即全身炎症反应综合征 （systemic in-flammatory response syndrome，SIRS），是一种潜在致命性的全身炎症，由严重感染引起[1]。有研究显示约40%的脓毒症患者出现急性肺损伤（acute lung injury，ALI）[2]。脓毒症的发生归因于宿主对感染的初始反应被级联放大并对宿主造成损伤。脓毒症的炎症反应过程是由激活的各种炎症细胞参与的复杂过程[3]。葛瑞林（Ghrelin）是一种28 个氨基酸的胃肠肽激素，具有广泛的生物活性，可促进生长激素的释放、影响脂肪和能量代谢、改善胰岛素抵抗。另有研究也表明它可增强机体的免疫及抗炎能力[4]。此前有研究报道，葛瑞林可减轻实验动物急性胰腺炎和结肠炎的炎症反应[5，6]，并可通过影响Akt 的活性减弱脓毒症所致的脑损伤[7]。本研究旨在探讨葛瑞林对脓毒症所致ALI 是否具有保护作用及其发挥作用的可能机制。

1 材料与方法

健康SPF 级C57BL/6 小鼠80 只（雌性、雄性各40 只），购买自SLRC 实验室（上海），鼠龄8～10 周， 体质量18～22g。将小鼠饲育在SPF 屏障内，在22°C～25°C 室温下保持每隔12h 的光/暗循环并自由饮水进食。葛瑞林，Ghrelin，购自吉尔生化上海有限公司，批号：20180812， 规格：5mg。

1.1 实验动物、分组

参照Rittirsch D 等使用盲肠结扎穿刺术（the cecal ligation and puncture，CLP）的方法[8]制作脓毒症小鼠动物模型。小鼠在实验前12h 禁食，自由饮水。小鼠40mg/kg 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，下腹部消毒、 备皮无菌操作， 在下腹部正中央切口，长约0.5～1.0cm，打开腹腔寻找盲肠，小心分离其远端与大肠的系膜， 实验组将盲肠结扎在回盲瓣下方，并用无菌21 号针头在已结扎盲肠远段中央处贯通穿孔，然后把盲肠推回腹腔，关闭腹腔，逐层缝合； 对照组仅做开腹分离盲肠远端与大肠的系膜及关腹手术。术后按50ml/kg 体重皮下注射生理盐水， 补充术中丢失的液体， 连续观察24h，整个实验在室温（22°C～25°C）下进行。

C57BL/6 小鼠80 只， 按随机数字法分为4组： 假手术动物 （对照组）、CLP 诱导脓毒症组（CLP 组）、 以磷酸盐缓冲盐 （PBS） 为溶媒治疗CLP 组 （CLP+PBS 组） 和葛瑞 林治疗CLP 组（CLP+葛瑞林组），每组均为20 只。除对照组外其他组均建立脓毒症模型并诱导ALI。术后2d 内，葛瑞林治疗组和PBS 治疗组小鼠腹膜内注射葛瑞林（80μg/kg/d，溶于PBS）和PBS 2ml（pH 7.2～7.4）。

1.2 取材和肺损伤的评定

术后d5，各组小鼠用CO2窒息法处死。取小鼠右肺一叶固定于4%多聚甲醛中，乙醇脱水，石蜡包埋切片。一部分经HE 染色，光镜观察染色区域病理变化。单盲法评估肺组织的损伤程度。肺损伤的评分依据肺泡充血、出血、血管壁内或壁间中性粒细胞浸润或聚集以及肺泡壁/透明膜形成的厚度。得出的平均值作为肺损伤的半定量组织学指标[9]。

1.3 髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性的测量

组织中MPO 活性参考Hillegass 等人[10]描述的程序来测定。肺组织制成匀浆，并将含有MPO的上清液与含有底物H2O2（1.5mmol）和邻联茴香胺二盐酸盐（167mg/ml，Sigma Aldrich）的50mmol KPO4缓冲液孵育30min。最后，使用96 孔板读数测量460nm 处吸光度的变化来测定酶活性。

1.4 支气管肺泡灌洗液 （bronchialveolar lavage fluid，BALF）细胞计数

气管暴露并用导管插管。左肺用无菌PBS 冲洗3 次， 每次0.5ml。灌洗后液体回收率平均＞90%。BALF 在4°C 下以2000rpm 离心10min，上清液在-80°C 下储存用于细胞因子和蛋白质分析， 细胞团块则重新悬浮在PBS 中用于细胞计数。

1.5 ELISA 测定炎性细胞因子

使用ELISA 试剂盒（USCNLIFE，中国武汉）检测BALF 中炎性细胞因子， 包括TNF-α、IL-6、IL-1β 和巨噬细胞炎性蛋白2 （macrophage inflammatory protein 2，MIP-2）的产生。将样品分3份分析，结果为3 次独立实验的x－±s。

1.6 Western blotting 分析

使用RIPA 裂解液低温匀浆裂解各组小鼠的肺组织匀浆30min，4℃12000rpm 离心20min，收集上清即得总蛋白溶液， 用Bradford 法测定样品蛋白浓度。取20μg 蛋白样品，经SDS-PAGE 电泳分离后转移至PVDF 膜上， 然后按照一抗（包括Akt、p-Akt 和β-actin）孵育，与辣根过氧化物酶结合的二抗杂交后用ECL 化学发光成像检测肺组织中Akt 和磷酸化的Akt。所有样品分3 份检测。

1.7 生存曲线

为了评价葛瑞林对脓毒症致ALI 小鼠存活的影响， 将对照组、CLP 组、CLP+PBS 组和CLP+葛瑞林组各取10 只小鼠， 每24h 进行存活率的测定，直到120h 的终点。

1.8 统计学方法

应用SPSS 16.0 软件进行统计学分析。符合正态分布的结果表示为均数±标准差（x－±s）。采用单因素方差分析、Fisher 最小显著差异检验分析组间差异。采用Kaplane Meier 分析测定存活率。

2 结果

2.1 对脓毒症ALI 的病理学损伤的影响

HE 染色后观察组织病理学变化， 正常对照组的小鼠没有明显的组织形态学损伤（图1A，见封二）， 与对照组相比，CLP 组的肺组织表现出显著的病理学异常（图1B，见封二），包括肺泡出血、肺泡壁增厚、 大量中性粒细胞和淋巴细胞浸润于肺泡腔内及壁间。与CLP 组和CLP+PBS 组 （图1C，见封二）相比，葛瑞林治疗组（图1D，见封二）的肺组织病理学损伤显著减轻。

表1 各组小鼠肺损伤指数、MPO 活性和BALF 炎性细胞总数

图2 各组小鼠BALF 中促炎细胞因子表达的变化

图3 葛瑞林对脓毒症ALI 小鼠肺组织Akt 磷酸化的影响

图4 葛瑞林治疗改善脓毒症致ALI 小鼠的生存率

各组小鼠肺损伤指数、MPO 活性和浸润的炎性细胞计数见表1。与CLP 组和CLP+PBS 组相比， 葛瑞林治疗组可显著降低肺损伤指数、 肺的MPO 活性和BALF 中炎性细胞浸润数量 （均P＜0.05）。

2.2 对BALF 中炎性细胞因子产生的影响

BALF 中TNF-α、IL-6、IL-1β 和MIP-2 的浓度， 如图2 所示， 在经过葛瑞林处理的小鼠肺BALF（治疗组）中，炎性细胞因子的产生，包括TNF-α （图2A）、IL-6 （图2B）、IL-1β （图2C）和MIP-2（图2D），与CLP 组和CLP+PBS 组相比显著降低（均P＜0.05）。

2.3 对激活Akt 信号传导通路的影响

Western blot 结果见图3，肺组织中Akt 的含量无明显变化；然而与对照组相比，CLP 组p-Akt的含量明显升高；与CLP+PBS 组相比，用葛瑞林治疗的ALI 小鼠的肺组织中p-Akt 含量显著降低（均P＜0.05）。

2.4 对脓毒症致ALI 小鼠存活率的影响

图4 示，与CLP 组和CLP+PBS 组相比，治疗后72h、96h 和120h，葛瑞林干预显著改善了脓毒症致ALI 小鼠的存活率（均P＜0.05）。

3 讨论

ALI 是由局部或全身炎症反应引起， 主要是脓毒症[3]。CLP 是一种广泛应用于体内模拟脓毒症的方法。由于盲肠充满细菌，对其进行穿刺结扎可致细菌性腹膜炎、细菌入血、脓毒症性休克、多脏器功能不全，最终导致死亡。CLP 被公认为是实验性诱导脓毒症或脓毒症致ALI 的金标准[11]。

脓毒症时， 机体与细菌之间复杂的相互作用可触发细胞因子网络的级联放大反应等多种炎症途径[3]。因此在脓毒症致ALI 中， 大量释放的TNF-α、IL-6 和IL-1β 等激发异常的免疫反应，导致肺组织损伤。我们的实验结果显示，葛瑞林治疗不仅改善了肺组织学，而且降低了肺损伤指数。同时， 葛瑞林治疗也能抑制脓毒症诱导的ALI 小鼠的炎症反应。与CLP 组和CLP+PBS 组相比，CLP+葛瑞林组的ALI 小鼠的MPO 活性、 炎性细胞计数、 炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β 和MIP-2 的分泌均降低。这些结果表明，葛瑞林通过抗炎机制对脓毒症致ALI 具有潜在的治疗作用。

已有研究显示， 编码上述炎性细胞因子的基因转录可由Akt 调控[12，13]，Akt 信号通路在炎症反应的调节中起着关键作用， 而且有研究显示，Akt通路可在炎症反应过程中被激活，激活的PI3K 诱导PIP3 和PIP2 的生成， 从而导致Akt 的激活（Akt 第473 位丝氨酸的磷酸化）， 随后，Akt 通过磷酸化下游分子，如GSK-3 和Bcl-2 家族，促进炎症过程中多种促炎症介质，包括细胞因子、趋化因子和黏附分子的表达[14，15]。因此，为进一步了解葛瑞林对脓毒症诱导的ALI 小鼠炎症反应抑制机制， 我们接下来检测了不同实验组肺组织中Akt的含量及其磷酸化水平。我们观察到，用葛瑞林治疗的ALI 小鼠的肺组织中的Akt 磷酸化受到明显抑制。结果提示葛瑞林阻断ALI 小鼠的炎症反应的作用机制可能与调节Akt 通路的活化有关。

存活率是评价药物疗效的关键指标。为了进一步评估葛瑞林对脓毒症致ALI 小鼠的存活影响，我们对各组小鼠进行了存活率的比较，结果提示葛瑞林干预显著改善了脓毒症致ALI 小鼠的存活率。

总之，在脓毒症诱导的ALI 小鼠中，葛瑞林可以改善肺组织学，延长存活时间，降低肺组织中促炎细胞因子的水平。这些潜在的治疗作用可能是与抑制Akt 信号通路相关。因此，葛瑞林可作为脓毒症致ALI 治疗的候选药物。