定量检测血清水通道蛋白4 抗体水平在视神经脊髓炎疾病谱中的临床意义

陈博

视神经脊髓炎属于中枢神经系统脱髓鞘疾病之一,是脊髓和视神经相继受累或同时受累所致。该疾病病理改变的关键为坏死空洞、硬化斑、脱髓鞘的形成,同时伴有血管周围炎性细胞浸润。Lennon 等［1］的研究使用间接荧光免疫法检测视神经脊髓炎患者的水通道蛋白4 抗体,之后研究者发现视神经脊髓炎不同于多发性硬化,均属于中枢神经系统脱髓鞘疾病,称为视神经脊髓炎疾病谱［2］。就目前的医疗水平,临床检测视神经脊髓炎疾病谱患者血清中的水通道蛋白4 抗体的检测方式多为定性检测,但检测较少。基于此,本文探究血清水通道蛋白4 抗体水平定量检测在视神经脊髓炎疾病谱中的临床价值和意义,具体研究内容和结论报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015 年7 月～2018 年7 月到本院及中国医科大学附属第一医院就诊的70 例中枢神经系统脱髓鞘患者,其中视神经脊髓炎疾病谱患者40 例［复发性视神经炎10 例及复发性长节段横惯性脊髓炎患者10 例(设为Ⅰ组)、视神经脊髓炎20 例(设为Ⅱ组)］、多发性硬化患者30 例(设为Ⅲ组),另选取同期体检的30 例健康者设为Ⅳ组。Ⅰ组与Ⅱ组均符合视神经脊髓炎及其疾病谱的临床诊断标准,男18 例、女22 例；年龄29～65 岁,平均年龄(45.25±8.64)岁；平均病程(2.98±0.39)年；脊髓受损段数4～8 个,平均脊髓受损段数(5.64±0.79)个。Ⅲ组男15 例,女15 例；年龄28～66 岁,平均年龄(45.28±8.47)岁；平均病程(3.01±0.41)年；患者均符合多发性硬化临床诊断标准。Ⅳ组男17 例,女13 例；年龄27～65 岁,平均年龄(45.41±8.25)岁。四组性别、年龄等一般资料比较,差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。

1.2 方法 血清水通道蛋白4 抗体检测方法：①试剂与仪器：通过间接荧光免疫沉淀法进行检测,水通道蛋白4 抗体酶联免疫试剂盒(武汉华美生物有限公司)、KHB ST-360 酶标仪(上海科华实验系统有限公司)、微量高速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司,型号：TG16-W)、附加可调节吸头及微量加样器、电热恒温培养箱、量筒、试管、容量瓶等。②检测方法：静脉采血,离心法分离血清,速度为3000 r/min,血清分离后存于-80℃。根据水通道蛋白4 抗体酶联免疫试剂盒的具体操作步骤进行,为确保精确,需将样品和标准品设置为双孔,加样时需使用微量加样器,此时注意由同一人完成操作,个标本均配特定吸头,且需使用同一批试剂,并严格控制反应温度和时间,使用KHB ST-360 酶标仪检测血清水通道蛋白4 抗体吸光度的［D(λ)］值,将正常状态下的吸光度平均值+3 倍标准差作为阳性检出的临界值。

1.3 观察指标 比较四组血清水通道蛋白4 抗体阳性检出率,分析血清水通道蛋白4 抗体荧光值与脊髓受累段数、视神经脊髓炎疾病谱水通道蛋白4 抗体呈阳性患者首次发病 2 年内复发次数的相关性。

1.4 统计学方法 采用SPSS20.0 统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。相关分析采用Pearson 相关性分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组中血清水通道蛋白4 抗体的阳性检出率分别为65.00%(13/20)、70.00%(14/20)、10.00%(10/30)、0,Ⅰ组、Ⅱ组中的血清水通道蛋白4抗体的阳性检出率明显高于Ⅲ组、Ⅳ组,差异有统计学意义(P＜0.05)。血清水通道蛋白4 抗体荧光值与脊髓受累段数呈正相关(r=0.136,P=0.017＜0.05)；视神经脊髓炎疾病谱水通道蛋白4 抗体呈阳性患者首次发病2 年内复发次数与抗体荧光值无相关性(P＞0.05)。有5例水通道蛋白4 抗体呈阳性的患者在接受硫唑嘌呤、强的松、甲强龙冲击等免疫抑制剂治疗1～4 个月后,体内的水通道蛋白4 抗体开始转变为阴性。

3 讨论

视神经脊髓炎是一种中枢神经系统脱髓鞘性疾病,可通过免疫抑制剂治疗,且疗效可见［3］。目前已有多家神经免疫中心建立了完善的检测方法用于检测血清水通道蛋白4 抗体的特异性和敏感性,率先建立了间接荧光免疫沉淀法和CBA 法。CBA 法仅限于在细胞表面的观察,属于定性检测,但是间接荧光免疫沉淀法为定量检测,主要用于测定水通道蛋白4 抗体滴度［4］。为了研究定量检测血清水通道蛋白4 抗体水平在视神经脊髓炎疾病谱中的临床意义,从而进行了本次研究。在本次研究中,主要通过间接荧光免疫沉淀法对视神经脊髓炎患者血清水通道蛋白4 抗体含量进行检测,分析脊髓受累节段数与血清水通道蛋白4 抗体存在的相关性。

最近几年,关于水通道蛋白4 抗体致病机制的研究有多种可能结果。例如水通道蛋白4 抗体与水通道蛋白4 胞外区接合,以致于水通道蛋白4 的表达缺失,最终造成脑脊液或者血液屏障的渗透性增强。另外还有水通道蛋白4 抗体的主要成分为免疫球蛋白G1 和水通道蛋白4(四聚体结构)可作为补体激活因子,粒细胞聚集起来后进入脑脊液或者血液屏障,从而发生抗体依赖和补体依赖的细胞毒作用,最终造成星形胶质细胞死亡。还有一种可能结果就是水通道蛋白4 发生内化造成兴奋性毒物的累积,此时会破坏髓鞘和少突胶质细胞的完整性。有研究表明［5］,视神经脊髓炎的致病性抗体极有可能就是水通道蛋白4 抗体,从此处推断病情严重程度可能与水通道蛋白4 抗体含量有一定关系。有研究通过CBA 法进行检测发现水通道蛋白4 抗体的滴度水平越高,患者失明的可能性越大,经磁共振成像检测发现患者脊髓受累段数越多［6］。有研究用间接荧光免疫沉淀法定量检测血清水通道蛋白4抗体含量,对50 例视神经脊髓炎疾病谱患者(其水通道蛋白4 抗体检测呈阳性)进行研究,发现病情严重患者以及预后情况较差的患者与病情较轻且预后较好的患者比较的结果显示水通道蛋白4 抗体含量无明显差异［7］。两种检测方法检测的结果不一致极有可能与采血时机以及样本采量有关,影响检测结果的准确性。

目前检测水通道蛋白4 抗体的方法多种多样,使用较多的有间接荧光免疫沉淀法、放射免疫沉淀法、CBA 法、流式细胞分析法以及酶联免疫吸附法。其中间接荧光免疫沉淀法的检测原理为人胚肾293 细胞被绿色荧光蛋白标记的水通道蛋白4 的cDNA 质粒转染,待细胞裂解后产生绿色荧光蛋白标记的水通道蛋白4游离蛋白,之后该抗原将其与未标记的水通道蛋白4抗体血清结合合成抗原抗体复合物,最终沉淀,此时借助荧光读板机测量其荧光值。水通道蛋白4 抗体滴度与荧光值直线相关,能准确的反映水通道蛋白4 抗体的含量。而CBA 检测水通道蛋白4 M23cDNA 质粒转染人胚肾293 细胞,此时细胞表面的已经完成表达过程的水通道蛋白4 抗原与血清抗体结合,在荧光显微镜下观察结合成功的抗原抗体复合物。研究显示［8］,CBA 法检测水通道蛋白4 抗体的特异性和敏感性较高,但是该检测方法并不适用于大批量检测,不能实现定量检测,而间接荧光免疫沉淀法检测弥补了这一缺陷,使用此方法可定量检测水通道蛋白4 抗体,并分析病情程度与抗体水平的相关性。

综上所述,血清水通道蛋白4 抗体水平能够帮助鉴别视神经脊髓炎疾病谱和多发性硬化,提高疾病的诊断准确性。