SV 预防血栓药理学作用及其机制研究探讨

阮锦达 梁惠莹

缺血性卒中、冠心病、静脉血栓栓塞等血栓栓塞性疾病是最主要的人类致死性病因［1］。作为临床预防和治疗血栓性疾病的基础手段,包括纤溶、抗凝、抗血小板药物在内的预防血栓药物均存在主要和共性的缺陷是具有出血倾向和严重出血危险。降低出血倾向、与病理性血栓形成相关而不影响生理性止血功能的药理学作用靶点是预防血栓基础药理学及新药应用研究的核心和重点。国内研究表明,SV 为来源于Stichopus variegatus 的岩藻糖化糖胺聚糖的解聚后纯化得到的纯品化合物九糖,SV 是选择性内源性凝血因子Xa 抑制剂(IC50=30 nm),Xase 是内源性凝血途径上的最后一个酶学位点,也是多种因素激发的凝血过程的限速位点［2-4］,其抑制内源性凝血活性与依诺肝素相当,在等效抗凝血剂量的倍数剂量下,出血倾向显著降低。

1 选择性内源性凝血因子抑制剂类预防血栓药物研发热点

1.1 内源性凝血因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ基因敲除能抵抗病理性血栓 生理性止血与病理性血栓形成存在时间和空间上的差异,生理性止血血栓在血管外周快速形成,而病理血栓则在血管内缓慢形成,理论上,其调节机制也应当有所不同。近年来,关于生理、病理凝血机制差异的基础研究正在取得进展,内源性途径在病理血栓和止血功能中的作用差异受到越来越多的关注［5-8］。缺乏凝血因子Ⅻ人群没有出血倾向,缺乏凝血因子Ⅺ出血倾向轻微,缺乏凝血因子Ⅸ出血倾向明显(如血友病B),临床罕见内源性途径及共同途径凝血因子完全缺乏者。基因敲除试验发现,内源性凝血因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ基因敲除动物的出血倾向与人体临床发现基本一致,而外源性途径及共同途径凝血因子基因敲除,则动物不能完成胚胎发育。近十年来的研究表明,Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ基因敲除动物均能抵抗病理性血栓形成［9-11］。

1.2 低出血倾向的内源性途径凝血因子抑制剂成研发的热点 一些基础研究结果表明,外源性途径及共同途径凝血因子为生理性止血以及基本生命功能所必须,但是内源性凝血因子Ⅻ非止血功能所必须,Ⅺ与止血功能弱相关,仅维持血栓稳定；Ⅸ参与凝血“扩增(propagation)”,但仅在低于正常血浆水平的5%情况下,才显著影响止血功能,如血友病。而内源性凝血因子与病理性血栓形成的相关性更为密切,理论上,选择性的内源性凝血因子抑制剂在抑制病理性血栓形成时可能较少或不影响止血功能,此为低出血倾向的药物研发开启一道希望之门。此外,应用研究发现,外源性途径Ⅶ抑制剂(单抗) 及重组组织因子途径抑制剂(TFPI) 的新药研发遭遇出血危险增加［12,13］。而一系列关于Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ抑制剂,包括单抗、适配体(Aptamer)、蠕虫抗凝肽等的预防血栓药理学研究显示,这些抑制剂在预防血栓剂量下对止血功能没有影响或影响较弱,选择性的内源性途径凝血因子抑制剂已成为新一代低出血倾向抗凝药物研发的重点方向。目前,内源性凝血因子抑制研究中,由于选择性Xase 抑制剂未见报道,FXase 抑制相关的预防血栓效应仍有待阐明。Xase 是内源性凝血途径上的最后一个酶学位点,也是多种因素激发的凝血过程的限速位点。从预防血栓药物研究进展来看,低出血倾向的新靶点抗凝药物研究正在期待突破,Xase 是内源性凝血途径的末位和限速酶活位点,是可能的抗凝药物作用靶点［14］。

2 研究实验方案设计及探讨

2.1 SV 对凝血途径激活所致关键凝血因子形成的影响 通过血浆化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)检测,可用于区分SV 对内源性凝血途径及外源性凝血途径的不同影响。病理性血栓与止血血栓的形成机制存在差异。例如,血浆微量成分如聚磷酸胺(APP)/聚丙烯(PP)的表面激活活性与缓慢的病理性血栓形成相关,而组织因子(TF)暴露及血小板活化释放的活性因子则诱导快速止血血栓形成。比较研究SV 对APP 和TF 诱发的凝血过程的抑制作用,可用于分析SV 低出血倾向预防血栓活性相关的药理学机制。凝血过程中的重要活性因子如Xa/Ⅱa 生成量检测可用于分析药物影响凝血过程的机制特征。血浆Xa 可由外源性途径的Ⅶa-TF 或内源性途径的Xase(Ⅷ-Ⅸa 复合物)激活形成。在稀释血浆系统中,由于反馈激活机制的参与,少量和过量TF 或Ⅻa 激活的Xa 以及下游Ⅱa 生成机制存在差异。Ⅱa 的生成量还与因子V 的反馈激活机制相关。乏因子血浆以及药理学工具药的使用,还可以进一步分析Xa/Ⅱa 生成量与药物靶点机制之间的相关性。因此,采用不同强度的内源性和外源性凝血激活方法,以生色底物法检测血浆Xa 和Ⅱa 的生成,可以细致和系统地分析SV 影响内源性、外源性及共同途径凝血过程的特征性机制。

2.2 SV 对血小板活性及血浆活性因子的影响 原型纤维蛋白原(Fg)存在血小板激活活性,而SV 已消除该活性,且对凝血酶等诱导的血小板聚集具有一定的抑制活性,对胶原、花生四烯酸(AA)等诱导的血小板聚集无显著影响。对比研究SV 对血小板活性的影响,可进一步认识SV 的预防血栓活性与其血小板活性影响的相关性。天然Fg 对血浆粘附因子,特别是P 选择素有显著的抑制活性,其机制可能与其“三糖结构单元”和唾液酸化的路易斯寡糖-X 抗原(SLex)三糖的空间结构相似相关。由于P 选择素等参与血栓形成,研究SV 的抑制活性,可进一步分析活性成分对血栓形成相关的复杂病理过程的干预。

2.3 SV 对血栓形成及出血倾向的影响 探讨采用实验动物学模型进一步分析SV 对不同因素所致血栓形成的抑制活性强度及其对止血功能,包括出血量和出血时间的影响。通过分别采用病理性血栓形成相关的表面激活(如Ⅻa,pp 等)以及止血血栓形成相关的外源性凝血途径(如组织因子、血小板活性因子等)激活因子所致血栓形成模型,可区分SV 预防血栓活性的机制特点及其对血栓和止血功能的影响差异。分析检测不同因素所致血栓形成过程中的活性凝血因子(如Xa、Ⅱa 等)水平、血小板活性以及粘附因子活性(如P 选择素)水平,可以进一步探讨SV 预防血栓活性和止血功能影响与其药理学靶点机制之间的相关性。通过不同给药途径 ［静脉注射(iv).皮下注射(sc)］下的药-时曲线和药效动力学(如APTT 影响)比较,分析其药代动力学和药效动力学之间的相关性,以考察其潜在应用价值。

3 研究前景

脑血栓形成是脑梗死最常见的类型。迄今为止,公认有效的脑梗死急性期治疗用药仅重组织型纤溶酶原激活剂(rtPA)一种,欧、美、日等发达国家长期以来开展大量的脑卒中治疗药物研究工作,但尚未取得突破性进展。脑梗死治疗药物研究基本上可归结于抗血栓和脑保护两个方向,抗血栓治疗时脑卒中对因治疗的主要措施为SV 的药理学作用是强效抑制内源性因子X 酶(FXase),后者是凝血瀑布中内源性凝血途径的最后一个靶点,具有良好的抗血栓活性,同时,与相同效价的作用共同途径的抗凝药物,对于出血倾向的影响显著降低。理论上,SV 强效作用于内源性途径的抗凝特征有利于保障脑梗死患者获益于抗凝治疗,同时抑制凝血瀑布中内源性凝血途径的最后一个靶点的药理学特点有利于降低出血倾向副作用,由此使患者获得更多的“净受益”。