中药复方干预糖尿病肾脏疾病db/db小鼠的实验研究进展

周盈 蔡倩 刘晴 王暴魁

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease，DKD)作为糖尿病最常见的微血管合并症，随着糖尿病发病率提高而危害凸显，其引起的慢性肾脏病的比例已超过肾小球肾炎[1]。糖尿病患者一旦出现蛋白尿，5年以后发生肾衰的患者占50%以上，10年以后发生肾衰的患者占80%以上[2]。

db/db小鼠是由C57BL/6J近交系中发现的由于瘦素受体基因缺陷的先天肥胖性2型糖尿病小鼠，是目前被广泛认可的研究人类2型糖尿病较好的动物模型。该模型具有早期脂质代谢紊乱、持续进展性高血糖等特点[3]，出生4周左右逐渐出现肥胖、高血糖、胰岛素抵抗和β细胞功能衰竭等症状，发病过程与人类2型糖尿病非常相似。该模型在7～8周时尿白蛋白排泄量明显增加[4]，肾脏开始出现DKD的改变，如肾小球系膜基质增加、基底膜增厚、小管扩张等[5]。8～16周龄时，小鼠肾脏体积增长达20%～30%[6]，16周龄后随着年龄增长，小鼠肾脏系膜细胞数量增加了3倍[7]。有研究发现，与诱发性糖尿病小鼠模型相比，db/db小鼠肾脏有明显变化，部分肾脏出现坏死，剖开后内部有大量水样液体，而诱发性模型肾脏则无肉眼可见的变化[8]。故db/db小鼠可作为研究DKD发病机制及药物防治较好的动物模型。

DKD发病分子机制复杂，现代研究认为涉及多种因素，包括糖代谢紊乱、脂代谢紊乱、氧化应激、炎症反应、细胞因子异常表达、自噬行为异常、肾血流动力学异常、遗传因素等。在各种因素的复合影响下，肾小球基底膜增厚、系膜细胞基质堆积，最终导致肾小球硬化及肾间质纤维化，失去正常滤过作用[3]，临床多表现为蛋白尿、肾功能下降。目前西医治疗主要使用降糖药、ACEI/ARB类、他汀类药物控制血糖、血压、血脂，通过治疗原发病来延缓病情进展，但临床疗效有限。近年来中药复方干预DKD db/db小鼠模型控制DKD进展的实验研究取得了一定进展，现根据不同机制进行综述。

1 糖代谢与脂代谢紊乱

糖代谢紊乱可以通过非酶糖基化及糖基化终产物(advanced glycation endproducts, AGEs)聚积、己糖胺通路、多元醇通路、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)途径等造成肾脏损伤。这些途径可以单一或共同造成后续的系膜细胞外基质(extracellular matrix, ECM)聚积、炎症反应、氧化应激、肾脏纤维化，造成肾脏损害。糖尿病导致的高血脂状态可直接损害肾脏，多余脂质沉积在肾脏引起ECM聚积，导致肾小球硬化和肾小管损伤。Gao等[9]以芪地糖肾颗粒(熟地黄、生黄芪、山萸肉、炒芡实、炙水蛭、熟大黄、白花蛇舌草)干预 db/db小鼠，发现该方可在不增加磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)和Akt表达的情况下提高其磷酸化水平，抑制蛋白激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase , p38MAPK)活化，降低肾组织中胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate-1, IRS-1)的丝氨酸(serine, Ser) 302、磷酸化胰岛素受体底物1(phospho-IRS1, Tyr896)磷酸化水平。进一步研究发现该方可下调胰岛素信号抑制因子p38MAPK活性，从而削弱其对IRS-1/PI3K/Akt信号通路的抑制，提高胰岛素信号通路活化水平，减轻肾脏胰岛素抵抗，从而保护足细胞。表明该方不但能够整体减轻DKD小鼠的胰岛素抵抗程度，还可增强肾脏对胰岛素信号的敏感度，对治疗DKD意义重大[10]。陈霞等[11]研究发现黄芪汤(黄芪、茯苓、瓜蒌根、麦门冬、北五味子、炙甘草、生干地黄)对磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phospho-AMP-activated protein kinase, p-AMPK)、磷酸化Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶β(p-Ca2+/Calmodulin dependent protein kinase kinase beta, p-CaMKKβ)、肝激酶B1(p-liver kinase B1, p-LKB1)、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶蛋白表达呈浓度依赖性增加，可激活AMPK-Camkkβ通路，通过调节脂代谢而延缓DKD的进展。进一步研究发现，该方还可作用于IRS1/PI3K/GLUT信号通路，上调p-IRY1361、p-IRS1Y896、p-PI3K、葡萄糖转运体(glucose transporters, GLUT)4，抑制p-IRS1S636/639、p-AKTT308、p-AKTS473、GLUT1，调节肾脏葡萄糖转运体的表达，通过改善葡萄糖再摄取延缓DKD进展[12]。

2 氧化应激

氧化应激导致活性氧族(reactive oxygen species，ROS)生成过多，其中一氧化氮合酶、NADPH氧化酶(NADPH oxidase, Nox)等均是其重要来源，其中研究较多的有Nox4、Nox2等，可以抑制三磷酸甘油脱氢酶活性，激活与糖尿病微血管病变发生发展相关的信号通路，与DKD的发生发展密切相关。此外，NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2, Nrf2)是抗氧化中发挥中心作用的核转录因子，相关通路可有效抑制氧化应激反应。刘华东等[13]以复肾汤(黄芪、大黄、水蛭、地龙等)干预db/db小鼠，可下调丙二醛(malondialdehyde, MDA)、血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF)、纤维结合蛋白(fibronectin,FN)水平，上调超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平，缓解DKD可能与抑制氧化应激和部分细胞生长因子表达、调节脂代谢等多种因素相关。张并璇等[14]以糖肾方(黄芪、生地黄、山茱萸、大黄、鬼箭羽、三七、枳壳)干预db/db小鼠观察NADPH氧化酶及Nrf2通路发现，糖肾方可显著抑制Nox2、Nox4、p22phox、Nrf2、NQO1表达，提高血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表达，通过降低肾脏NADPH氧化酶表达，减少活性氧(reactive oxygen species,ROS)堆积，抑制Nrf2入核，起到抗氧化应激、减轻肾损伤的作用。

3 炎症反应

炎症反应与DKD的发生发展密切相关，包括单核细胞趋化因子(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、白介素(interleukin, IL)、细胞黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、Janus激酶/信号转导子和转录激活因子通路(the janus kinase /signal transducer and activator of transcription pathway, JAK/STAT)、核因子kB(nuclear factor kB, NF-kB)相关通路等。陈勇等[15]以石斛合剂(石斛、黄芪、丹参、五味子、葛根、知母、生地黄、地龙等)干预db/db小鼠发现，该方可显著抑制肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、MCP-1、ICAM-1、IL-6等细胞因子表达，抑制炎症反应，延缓DKD进展。Mei等[16]观察糖肾方(黄芪、生地黄、三七、大黄、枳壳、山茱萸、鬼箭羽)对细胞因子抗体阵列影响发现其可下调24种炎症相关细胞因子，包括IL-2、IL-6、IL-13、IL-15、干扰素-γ，通过调节JAK/STAT信号通路起到抑制炎症反应治疗DKD的作用。Hu等[17]以糖肾方(黄芪、地黄、三七、大黄、山茱萸等)干预db/db小鼠发现，该方可提高JAK1、JAK2、STAT3表达，抑制STAT4表达，激活钙库操控Ca2+通道(store-operated calcium, SOC)蛋白。而细胞因子信号传导抑制剂1(suppressor of cytokine signaling 1, SOCS-1)作为JAK/STAT信号通路的负性调控因子在肾脏中过表达可延缓DKD进展[18]，提示糖肾方可能通过调节JAK/STAT/SOCS通路起到治疗DKD的作用。滑先东等[19-20]以复方鱼腥草合剂(鱼腥草、牛蒡子)不同提取物干预db/db小鼠，同样发现该方可抑制JAK/STAT信号通路，且对比不同提取物还发现正丁醇组和水提取物组亦可提高SOCS-1基因及蛋白表达。

4 细胞因子异常表达

多种细胞因子的异常表达与DKD的发生密切相关，研究较多的有转化生长因子-β (transforming growth factor-beta, TGF-β)、TNF-α。TGF-β作为糖代谢紊乱、细胞因子等多种因素引起肾损伤共同的重要中介，与其下游信号Smad在肾纤维化进程中扮演了最有力的驱动者。TNF-α在高血糖状态下可介导炎症等多种改变导致DKD。段颖等[21-22]用固肾降白颗粒(黄芪、白术、薏苡仁、赤小豆、地龙、五味子、丹参、黄柏)干预db/db小鼠，发现该方可下调肾组织中TGF-β1、Smad3、α-平滑肌肌动蛋白 (α-smooth muscle actin, α-SMA)，上调E钙黏连蛋白(E-cadherin, E-cad)、骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein, BMP)-7，减缓肾脏纤维化。房芸等[23]、史晓伟等[24]分别发现复方鱼腥草合剂(鱼腥草、牛蒡子)和糖肾康(杜仲、黄芪、大黄、桃仁、金樱子、芡实、水蛭、泽泻)均可减少ECM蓄积，减轻肾小球硬化和肾间质纤维化程度。刘鹏等[25]发现糖肾方(黄芪、生地黄、山茱萸、三七、卫矛、熟大黄、枳壳)不仅可下调TGF-β1、Smad3、胶原(collagen, Col)I、 FN的表达，还可下调miRNA29b，上调miRNA21，通过调节肾脏纤维化相关miRNA，减缓DKD肾脏纤维化。

5 自噬行为异常

生理状态下自噬行为作为一种高度保守的自稳调控机制，主要表现为包裹并降解细胞内蛋白和细胞器，可以维持不同应激状态下的细胞稳态。DKD时肾脏中高糖高脂状态会抑制足细胞自噬水平，其中AMPK信号通路被抑制，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路作为自噬负性调节机制被激活与DKD发病关系紧密。Zhao等[26]研究发现糖肾方(黄芪、鬼箭羽、地黄、枳实、山茱萸、大黄、三七根)可抑制db/db小鼠肾脏早幼粒细胞白血病锌指(promyelocytic leukaemia zinc finger, PLZF)和ColⅢ，通过抑制PLZF表达，诱导细胞自噬，上调自噬水平，促进ColⅢ自噬降解，减轻肾损伤。

此外，还有学者进行其他机制及多种机制的研究，Peng等[27]研究发现糖肾方(黄芪、生地黄、山茱萸、三七、鬼箭羽、熟大黄、枳壳)可促进ATP结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)介导的胆固醇外流，减少肾脏胆固醇蓄积治疗DKD。郑燕芳等[28]研究发现石斛合剂(石斛、黄芪、丹参、葛根、五味子、生地黄、川牛膝、知母、地龙、白花蛇舌草等)和六味地黄丸 (熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻)均可下调db/db小鼠肾脏水通道蛋白(aquaporin, AQP)2、AQP3的表达，其中AQP2维持机体水平衡，并参与尿液浓缩和渗透压调节[29]，恢复体内水代谢平衡, 从而防治早期DKD损害。Jung等[30]以五苓散(泽泻、猪苓、白术、茯苓、桂枝)干预db/db小鼠发现可抑制TGF-β1、p-Smad2、ColIV、结缔组织生长因子、金属蛋白酶组织抑制因子-2、ICAM-1和MCP-1的表达，提高膜型基质金属蛋白酶、Smad7表达，五苓散可调节TGF-β1/Smad通路，减少ECM堆积，减轻炎性反应损伤，多通路多靶点地治疗DKD。

6 问题与展望

DKD的发病机制尚未清晰，涉及到多条信号通路和多个作用靶点，这些信号通路、作用靶点虽作用不同却又错杂交纵、紧密联系，目前西药治疗难以从源头截断疾病发展或多途径覆盖相关靶点。而研究发现，中药复方治疗DKD优势显著，不仅可以改善临床症状，还可通过多靶点多途径截断病机，更加全面地减缓病程进展，逐渐受到重视。通过动物实验探索其作用的分子机制，可为中药复方治疗DKD提供实验基础及处方思路，证实中药复方治疗DKD的科学性。

根据以上有关中药复方干预DKD db/db小鼠实验研究，可发现不同中药复方可作用于相同或类似的分子机制，同一中药复方也可作用于多个通路调控多种分子机制。可以确定的是，基于辨证论治形成的有效中药复方可不同程度地缓解DKD进程，且多种复方的研究表明，中药复方并非单一作用，而更倾向于多靶点多途径贯穿治疗始终。一般来说db/db小鼠病至晚期不会发生肾小球膜溶解或结节性肾小球系膜硬化，也不会发展为进行性肾功能不全[31],是研究人类早中期DKD的理想动物模型，而上述实验证实了中药复方在DKD早中期干预的疗效显著，且对于DKD晚期肾脏纤维化在分子学层面存在预防作用。提示中医药治疗DKD应从早中期着手，对疗效与预后有关键作用。

但目前中药治疗DKD机制的研究仍存在诸多不足：(1)从目前掌握的研究结果分析，中药并非单纯作用某一个靶点或某一个通路，常出现对多机制同时作用的现象，要求实验人员在设计实验时要尽可能涉及多个通路、多个靶点，避免以偏概全；(2)不同复方对于靶点覆盖程度以及多种机制对疾病的贡献度尚不清晰，一方面需要优化实验方案，另一方面需要基于大数据探索不同复方作用之间的异同；(3)在动物实验研究的同时，要将研究成果应用到中医的辨证用药中去，将现代科学成果为中医所用，用微观变化解释中药复方疗效的科学内涵；(4)中药复方受药材质量、剂量不同、煎煮方法、给药方式等影响存在较大的不稳定性，不可避免对实验结果产生影响，建议今后探索中药有效成分，更好地发挥中医药治疗DKD的优势；(5)实验研究应以“治病为本”的原则出发，证明中药有效性不是最终目的，在研究中药作用机制的同时更应中西医结合优化DKD的治疗方案，发挥西药的优势，对比不同干预方法的作用差异，为临床延缓DKD病程，提高患者生存质量谋福利。本研究望通过中药复方治疗DKD分子机制的研究，进一步明确中药作用机制，为治疗DKD提供新思路。