高迁移率族蛋白B1在脑出血炎症损伤和修复中的作用研究进展

栗春梅，俞晓飞

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是临床常见的急性脑血管疾病，占脑卒中总发病率的10%～15%，是最严重的脑卒中亚型，致残率、致死率非常高[1-3]。脑出血后脑损伤包括原发性损伤和继发性损伤，其中原发性损伤是由于血肿占位和颅内压增高导致；继发性损伤是由于血肿释放其分解产物，如凝血酶和亚铁离子等，可刺激脑组织释放炎性因子，诱导炎症反应使得血脑屏障通透性增加，出现脑组织水肿、血肿周围神经细胞凋亡等一系列损伤[4]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein，HMGB1)作为一种重要的炎性因子，近期由于其在炎症损伤和组织修复中的双重作用，引起了广泛的关注[5-6]。研究提示脑出血急性期HMGB1作为早期促炎细胞因子可促进脑出血后的炎症反应[7]，通过与糖基化终末产物受体(RAGE)[8]、Toll样受体(TLR)中的TLR2、TLR4[9]等相结合，转导细胞内信号并介导细胞反应，促进破坏性炎性因子的释放而介导炎症反应。脑出血恢复期，HMGB1亦可以通过促进神经细胞增殖、迁移及血管内皮生长因子表达，从而介导神经发生、血管再生等有益神经功能恢复的作用[10]。

1 HMGB1概述

HMGB1是一种具有内源性细胞因子活性的核蛋白，广泛表达于包括神经细胞在内的大多数真核细胞中。生理条件下，HMGB1定位于细胞核，其功能为稳定核小体结构，促进基因转录。病理条件下，HMGB1从细胞核释放到细胞外空间时起促炎细胞因子的作用[11]。HMGB1作为损伤相关的分子模式(DAMP)可通过与细胞膜表面多种受体结合，包括RAGE、TLR2和TLR4等，引发信号转导，促进免疫细胞释放细胞因子[如白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)]及其他致炎细胞因子，进而激活并触发下游炎症反应。

研究表明HMGB1的细胞外生物学功能可能取决于HMGB1蛋白 C23、C45和C106位点上半胱氨酸残基的氧化还原修饰状态[12]。根据氧化还原状态的不同，HMGB1有3种形式，即还原型HMGB1、二硫化型HMGB1、氧化型HMGB1。炎症损伤使活性氧(ROS)、活性氮(RNS)等氧化信号在细胞内积聚，诱导HMGB1发生不同程度的氧化反应，使其从细胞核转位至细胞浆，或释放到细胞外。生理条件下细胞核HMGB1是C23、C45、C106位点均连接硫醇侧链的还原型HMGB1(SH-SH-SH)。当还原型HMGB1直接被释放到细胞外环境中时，ROS/RNS将其部分氧化，形成二硫化型HMGB1(S-S-SH)。当细胞处于高度氧化环境或有大量ROS/RNS释放时，细胞氧化损伤严重，HMGB1呈氧化型HMGB1(R-SO3H)。还原型HMGB1可作为一种趋化因子，可以与CXC趋化因子配体12(CXCL12)形成一个趋化因子复合物，并通过激活CXC趋化因子受体4(CXCR4)，或与RAGE受体相互结合从而募集炎性细胞并诱导其向损伤组织、炎症区域定向迁移[13-14]。二硫化型HMGB1通过结合TLR4/MD-2复合物诱导炎症细胞产生一系列细胞因子促进炎症反应[15]。Venereau等[16]研究发现，在肌肉损伤模型中，还原型HMGB1在肌肉损伤后2 h在细胞外环境中普遍存在，而二硫化型HMGB1在6 h后出现，表明还原型HMGB1首先释放到细胞外从而募集炎症细胞向损伤组织区域迁移，然后免疫细胞(如单核巨噬细胞等)直接分泌二硫化型HMGB1，或者通过ROS/RNS部分氧化细胞外还原型HMGB1间接产生二硫化型HMGB1。最终，持续的ROS/RNS诱导生成氧化型HMGB1，在炎症消退过程中HMGB1被氧化而灭活。氧化型HMGB1介导细胞的免疫耐受，既无趋化因子活性也无细胞因子刺激活性。然而，近期有研究发现氧化型HMGB1能够促进损伤组织修复。Yang等[17]研究发现在乙酰胺基酚诱导肝损伤小鼠模型中，采用质谱分析仪分析，炎症早期血清HMGB1以二硫化型HMGB1活性形式存在，诱导巨噬细胞产生炎性因子；炎症消退和肝再生过程中以氧化型HMGB1非活性形式存在。结论提示了半胱氨酸残基的氧化还原状态调节HMGB1的细胞因子活性。

2 HMGB1与脑出血

2.1 HMGB1在脑出血急性期的炎性损伤作用 HMGB1正常情况下主要存在于神经元细胞核内，脑出血损伤后由坏死神经元释放，或由巨噬细胞等免疫细胞主动释放。HMGB1释放到细胞外，作用于相应受体，促进炎性因子的流入介导神经血管单元炎症，出现小胶质细胞活化、增加血脑屏障通透性、脑水肿、神经元凋亡等一系列炎性损伤。

研究显示脑出血小鼠血肿周围组织中HMGB1水平明显升高，72 h达到高峰，5 d下降[18]。HMGB1在脑出血后1 h内被释放到胞浆内，释放的HMGB1有助于小胶质细胞的活化，引起炎症反应，诱发脑水肿、神经细胞凋亡导致脑损伤[7]。临床研究发现脑出血病人血清HMGB1水平明显升高，并且与IL-6、TNF-α等炎性因子水平，第10天美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分及3个月改良Rankin量表(MRS)评分明显相关[18]。HMGB1的释放增强脑出血后炎性因子表达，这些炎性因子的上调可能有助于星形胶质细胞增殖和血肿周围区域的中性粒细胞募集，并导致血脑屏障损伤和脑水肿。抗HMGB1抗体抑制HMGB1释放至血肿周围细胞间隙，降低血清HMGB1水平，减少活化的小胶质细胞和炎性相关因子的表达，保护血脑屏障的完整性，减少脑水肿[19]。有实验研究发现，给予丙酮酸乙酯(EP，HMGB1抑制剂)后脑出血大鼠血肿周围HMGB1和活化小胶质细胞表达明显降低，神经元凋亡、脑水肿和神经功能缺损情况明显改善[7]。

脑出血急性期，释放至细胞外的HMGB1作为促炎因子，主要通过识别表达在小胶质细胞、巨噬细胞上的TLR或者RAGE受体，激活小胶质细胞、巨噬细胞放大炎症反应。研究发现HMGB1通过与其受体TLR4结合之后可以靶向上调神经元及星形胶质细胞中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达，从而降解基底层，破坏血脑屏障结构，血脑屏障通透性增加，诱发脑水肿，导致神经炎症反应加重[20]。HMGB1-TLR4-NF-κB在脑出血后继发性损伤中有重要作用，利用丙酮酸乙酯处理后，HMGB1表达下调，下游炎症介质(IL-1β、TNF-α)表达亦下调，并改善脑出血引起的脑水肿和神经功能损害[21]。实验研究发现，HMGB1-RAGE信号在脑出血急性期可介导炎症反应，用丙酮酸乙酯或FPS-ZM1(RAGE受体抑制剂)处理后，大鼠脑出血血肿周围炎性细胞浸润及白细胞介素1(IL-1)、MMP-9表达明显降低，脑水肿、出血量和脑损伤明显减少[22]。

2.2 HMGB1在脑出血修复期的促修复作用 近年来，研究者发现HMGB1其在脑出血后期的潜在有益作用，HMGB1能够促进神经再生和血管生成以支持神经功能的恢复[10]。Lei等[10]发现HMGB1在脑出血后期促进神经发生和血管生成，造模后第7天～第14天给予丙酮酸乙酯每日1次，发现HMGB1表达下调，同时第10天和第14天同侧纹状体中的血管内皮生长因子(VEGF)和神经生长因子(NGF)水平降低，5-溴-2脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和血肿周围的双皮质素(DCX)双标阳性细胞数减少，提示新生神经元细胞数减少。张会敏等[23]体外实验研究发现外源性重组HMGB1可促进胚胎神经干细胞(NSCs)的增殖和分化。

Lei等[24-25]研究发现脑出血后14 d HMGB1、RAGE、脑源性神经营养因子(BDNF)、VEGF、MMP-9相关因子表达以及BrdU和DCX阳性细胞数量均明显高于基线水平给予丙酮酸乙酯后可明显抑制脑出血诱导蛋白表达的增加。FPS-ZM1给药后BDNF、VEGF和MMP-9的表达以及BrdU和DCX阳性细胞数减少，提示脑出血后HMGB1-RAGE信号通路可能促进脑出血后神经发生及血管再生。Wang等[26]研究发现HMGB1通过激活MAPK通路增强NSCs增殖，而内源性敲除HMGB1表达，MTS/BrdU检测显示敲除HMGB1明显抑制NSCs增殖，同时发现NSCs中的HMGB1表达下调抑制了ERK、JNK、p38的磷酸化，消除了MAPK信号通路对细胞增殖的作用。Hayakawaa等[27]体外实验研究发现活化星形胶质细胞可以在卒中恢复过程中释放HMGB1促进内皮祖细胞(EPCs)增殖介导的神经血管重塑。siRNA抑制星形胶质细胞中的HMGB1或阻断EPCs中的RAGE受体可以防止这种反应。提示刺激星形胶质细胞可释放HMGB1与EPCs上的RAGE受体结合，促进EPCs增殖，介导神经血管重塑。Li等[28]研究发现活化星形胶质细胞释放的HMGB1在体外促进神经干细胞/祖细胞(NS/PCs)增殖，在NS/PCs中阻断RAGE或抑制JNK信号通路可抑制HMGB1诱导的NS/PCs增殖。表明活化星形胶质细胞释放的HMGB1通过结合RAGE并且增强JNK信号通路的磷酸化促进NS/PCs增殖。提示RAGE-JNK信号通路的激活在活化星形胶质细胞释放的HMGB1促进NS/PCs增殖中有重要作用。Xue等[29]体外实验研究表明HMGB1通过丝状伪足形成促进NSCs迁移，FPS-ZM1和RAGE特异性的siRNA可以消除增强NSCs的迁移效应。提示HMGB1-RAGE轴通过促进丝状伪足形成促进NSCs的迁移，促进脑出血受损区域的修复。

HMGB1在脑卒中后的双重生物学作用可能取决于其半胱氨酸残基的氧化还原状态。脑卒中后细胞外HMGB1的氧化还原状态可能决定其损伤及修复作用。研究发现在蛛网膜下隙出血模型注射二硫化型HMGB1和氧化型HMGB1，蛛网膜下隙出血 14 d后，与溶剂组相比，二硫化型HMGB1组NGF、BDNF、VEGF的表达及DCX和BrdU阳性细胞数均降低，尼氏染色显示神经元数量明显减少，而氧化型HMGB1组结果与之相反。同时发现二硫化型HMGB1组血清和脑脊液中TNF-α水平及脑含水量明显高于溶剂组，氧化型HMGB1组与溶剂组比较差异无统计学意义。二硫化型HMGB1组神经功能缺损评分明显高于溶剂组，而氧化型HMGB1组神经功能缺损明显改善。蛛网膜下隙出血加入二硫化型HMGB1，可增加蛛网膜下隙炎性因子水平。结果提示二硫化型HMGB1可以作为炎症的启动子，并参与蛛网膜下隙出血后大鼠炎性细胞因子的表达，氧化型HMGB1没有显示出促炎作用，反而增加了生长因子水平，促进神经元存活[30]。因此，研究脑出血后HMGB1不同氧化还原状态，将有助于了解其在脑出血不同时期的生物学作用，通过干预HMGB1的氧化还原状态，进而抑制HMGB1的炎性损伤，促进神经血管再生，或许可能成为脑出血药物研究的新靶点。

3 结语与展望

HMGB1在脑出血后发挥复杂的双向作用，在脑出血急性期有促炎作用，在恢复期发挥有益作用。HMGB1-RAGE信号通路介导了脑出血急性期的炎症反应，并且在脑出血恢复期可以促进神经发生和血管重塑，突出了HMGB1和RAGE在脑出血组织反应中的复杂作用。此外，HMGB1氧化还原状态可能与体内微环境有关，不同的氧化修饰决定其功能状态，氧化型HMGB1可能促进组织损伤修复。近年来，中医药多靶点治疗脑卒中作用日益受到重视。中药复方对于疾病的治疗作用往往不是单向的，因其复方中不同药物成分发挥协同作用，常常可以起到双向调节的功效。研究发现生地大黄汤对脑出血大鼠有确切的神经保护作用，通过抑制脑出血大鼠急性期HMGB1/TLR4/MMP-9信号通路表达，改善脑组织炎性损伤，减轻脑水肿，减少神经细胞凋亡数，降低神经功能缺损评分，有效促进脑出血损伤恢复[31-32]。因此，进一步深入研究中药通过抑制二硫化型HMGB1促进氧化型HMGB1形成，从而抑制炎症反应促进神经血管重塑，具有重要的临床价值和科学意义。