3种不同炮制方法对白土茯苓中β-谷甾醇含量的影响

江 川 黄玉芳 章 靓 卓 实 林 雄

福建中医药大学附属人民医院药学部，福建福州 350001

白 土 茯 苓（Rhizoma Heterosmilacis，RH）也被称为白土苓或者土茯苓，作为一种传统中药材白土茯苓属于百合科植物肖菝葜属的华肖菝葜、短柱肖菝葜的干燥块茎[1]。白土茯苓多生于海拔 500 ～1800m，在我国四川、陕西、安徽、甘肃、云南等地均有分布，秋、冬二季采挖，目前仅收录于贵州省以及四川省的中药材标准之中。临床研究分析表明白土茯苓具有通利关节、清热、解毒、除湿的功效，临床上一般用于治疗疥癣、湿热淋浊、杨梅毒疱等疾病并具有突出的效果[2-3]。现代药理研究表明，白土茯苓具有调节水与电解质平衡，镇静、抗癌和降低血糖等作用。白土茯苓的主要成分是β-谷甾醇，β-谷甾醇能够抗癌抗炎、降低胆固醇、止咳、抗氧化等作用，可作为白土茯苓及其制剂的质量评价标准之一[4-5]。本研究探讨不同炮制方法对白土茯苓中3 种β-谷甾醇含量的影响。

1 资料与方法

1.1 试验仪器

可调式移液仪（购于北京大龙生物仪器有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；紫外分光光度计（北京瑞利仪器有限公司）；低速自动平衡离心机（北京雷勃尔仪器有限公司）； ZORBAX C18柱 色 谱 柱（Agilent，250mm×4.6mm，5μm）；1260 HPLC 色谱分析仪（Agilent）。

1.2 试药

同一批次（批号：S02156）生白土茯苓药材购自安徽芝神堂药业有限公司，经鉴定为百合科植物短柱肖菝葜（Heterosmilax yunnanensis Cagnep）；β-谷甾醇标准品购于中国食品药品检定研究院，β-谷甾醇标准品纯度均在99%以上。

1.3 检测试剂

三氯甲烷、色谱级磷酸、乙腈均购于德国默克股份有限公司；甲醇、纯无水乙醇、磷酸等试剂均购于中华试剂网。

1.4 方法

1.4.1 不同炮制品的制备 （1）生切品。取发汗后的新鲜茯苓净药材，白茯苓切成厚片，80℃烘干即可。（2）传统蒸切品。将发汗后的新鲜茯苓净药材置于普通蒸锅内，隔水蒸制，武火至圆汽后改用中火蒸1h，冷却后取出，白茯苓切制成厚片，80℃烘干即可。（3）高压蒸切品。将发汗后的新鲜茯苓净药材置于高压锅内，隔水蒸制，武火蒸至圆汽后改用中火蒸2h，稍冷后取出，冷却后取出，白茯苓切制成厚片，80℃烘干即可。每个平行3 份。

1.4.2 供试品溶液的制备 不同白土茯苓炮制品，粉碎后过20 目筛，精密称取2.0g，置具塞三角瓶中，加20mL 甲醇，精密称定，超声处理30min，冷却后再精密称定，甲醇补重，将制品通过0.45μm 微孔滤膜进行过滤，操作完成后取续滤液进样。

1.4.3 制备对照溶液 取β-谷甾醇标准品2.0mg于10mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得0.2mg/mL的对照品溶液。

1.5 方法学考察

1.5.1 色谱条件 采用HPLC 法检测β-谷甾醇含量，流动相：乙腈（A）和0.5%磷酸水（B）；色谱柱：Agilent ZOBAX C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；梯 度 洗 脱：0 ～5min，90% ～80%A；5 ～30min，80% ～70 %A；30 ～35min，70% ～90%A；进 样量：10μL；检测波长：210 nm；柱温：35℃；流速：1.0mL/min。

1.5.2 精密度试验方法 取5mL 供试品溶液按照色谱条件进行连续进样，共操作6 次，操作完成后计算各化合物峰面积RSD。

1.5.3 线性回归分析 吸取10 mL 对照品溶液于量瓶中，采用甲醇进行梯度稀释，操作完成后获得标准浓度溶液，按照色谱条件将标准浓度溶液注入色谱仪，将峰面积作为纵坐标、进样量作为横坐标进行线性回归分析。

1.5.4 稳定性试验方法 取5mL 供试品溶液并分别在0、2、4、8 和10h 不同时间点按照色谱条件进行连续进样，共操作6 次，操作完成后计算各化合物峰面积RSD。

1.5.5 重复性试验方法 取白土茯苓药材6 份，每份5g，按2.1 项下方法平行制取供试品溶液并测定，计算各化合物峰面积RSD。

1.5.6 回收率试验方法 取白土茯苓药材3 份，分别精密加入对照品适量，按照生切品及高压蒸切品方法平行制取供试品溶液，操作完成后进行测定并计算各化合物回收率。

1.6 含量测定方法

取生切品及高压蒸切品方法制作的生白土茯苓以及3 种不同炮制方法的白土茯苓样品进行含量测定，采用计算机软件并以峰面积代入标准曲线方程进行计算，平行3 份得到不同有效成分含量进行分析。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0 统计学软件进行统计学分析，对本次研究各个炮制时间样品进行系统聚类分析；P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 线性回归分析情况

β-谷甾醇在0.02 ～0.10mg/mL 范围内线性关系良好。见表1。

表1 白土茯苓中β-谷甾醇线性回归分析情况

2.2 精密度试验、稳定性试验和重复性试验结果比较

结果显示β-谷甾醇RSD 在5%以下，10h 内样品稳定。见表2。

表2 HPLC方法检测白土茯苓β-谷甾醇精密度、稳定性和重复性

2.3 回收率试验

β- 谷甾醇平均回收率为99.15%，RSD 为1.65%。见表3。

表3 白土茯苓中β-谷甾醇HPLC方法学考察回收率试验结果（%）

2.4 含量测定

白土茯苓生切品中β-谷甾醇最高，其次为传统蒸制品和高压蒸制品。见表4 和图1。

图1 不同炮制方法对白土茯苓β-谷甾醇含量的影响

3 讨论

虽然白土茯苓与《中国药典》中收载的土茯苓药名相近，但二者确为两个不同属的植物[6]。《本草纲目》中有记载“土茯苓分赤白二种，入药用白者良”，其中提及的赤者就是土茯苓，白者为白土苓。在我国很多地区常把白土茯苓当作土茯苓使用，市场上药材品种混乱，真伪难辨。目前，对白土茯苓的化学成分的研究还不多见，其有效化学成分多大十几种，如黄酮及黄酮苷类、甾体皂苷、酚及酚苷类、苯丙素类、有机酸类等[7-10]。白土茯苓具有广泛的药理作用，如抗菌、抗炎、镇痛、免疫抑制、调节血脂和β-受体阻滞样作用等[11-12]。

表4 不同炮制方法对白土茯苓β-谷甾醇含量的影响（%，n=3）

β-谷甾醇是白土茯苓的主要化学成分之一，临床上一般将β-谷甾醇作为评价白土茯苓及炮制品的质量标准，另外β-谷甾醇具有抗癌、抗高血脂、抗氧化、抗炎、防治高血压作用。临床研究显示，β-谷甾醇可通过抑制胆汁和膳食中的胆固醇的吸收发挥降胆固醇的作用，有动物实验证实其可显著降低高血脂大鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平，调节脂质代谢，抑制脂质过氧化，预防动脉粥样硬化过程。此外，β-谷甾醇还具有十分明显的抗炎作用[13-14]。β-谷甾醇被证实可明显降低经组胺诱导所致的皮肤毛细血管通透性增加小鼠的血管通透性水平，表现出良好的抗炎的活性[15]。有动物实验证实，β-谷甾醇能够抑制肿瘤细胞的增殖、分化与增生，同时还可诱发肿瘤细胞凋亡[16-18]。由此可见，β-谷甾醇是白土茯苓中的主要有效成分之一，研究其含量对于规范化白土茯苓的炮制标准具有十分重要的意义。

目前，关于白土茯苓炮制工艺的研究还十分有限，杨武德等[19]为了明确不同炮制方法对患者机体中茯苓总糖含量的影响，对不同茯苓生品及不同炮制品多糖含量的变化情况进行分析和考察，结果表明不同的炮制方法对茯苓多糖含量有显著性的增加作用，多糖含量从高到低顺序依次为米汤制、明矾米汤制、朱砂制生品、土炒。本研究采用HPLC 法检测土茯苓中β-谷甾醇的含量，并进行了方法学验证，该方法稳定、准确可靠，只需要在常温下进行，操作简便、快速，是监测白土茯苓中且β-谷甾醇的含量的可靠依据。同时，本研究对白土茯苓的生切品、传统蒸制品和高压蒸制品中β-谷甾醇含量采用上述方法进行检测，结果表明，白土茯苓3 种炮制品中含有的 β-谷甾醇含量不同，其中白土茯苓生切品中最高，其次为传统蒸制品和高压蒸制品。由此可见，生切品中β-谷甾醇含量保留程度最高，本次实验中白土茯苓炮制品的分析为研究白土茯苓组方提供了一定的实验基础。导致这一现象发生的原因可能是由于白土茯苓经过蒸制后，由于β-谷甾醇对热压不稳定，且热压越大，β-谷甾醇含量越低。

综上所述，白土茯苓生切品对β-谷甾醇含量最为有利，本研究可为白土茯苓饮片的规范化加工和质量控制提供参考。但由于本研究只是针对β-谷甾醇一种有效成分进行测定，该研究结论尚需综合评价方法的验证。