银杏叶对脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡、bcl-2和Bax表达的影响

缺血再灌注是大多数缺血性脑血管疾病的主要病理过程，坏死主要以损伤缺血中心区为主，神经细胞凋亡主要以损伤在边缘区为主，其中边缘区的神经元死亡直接影响病人脑梗死的体积[1-2]。所以在临床上要尽量减少边缘区神经元细胞的凋亡，使脑梗死的范围减少，使梗死程度降低。目前认为，bcl-2和Bax与神经元细胞的凋亡密切相关[3]。本实验研究银杏叶对脑缺血再灌注后损伤神经细胞凋亡、bcl-2和Bax表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 山东绿叶制药有限公司实验动物中心提供的合格健康雌性SD大鼠40只，动物合格证号：SCXK(鲁)20140009，体质量175～220(210.43±17.02)g，

1.1.2 试剂与仪器 试剂：Dr.Willmar Schwabe GmbH & Co.KG生产的(商品名：金纳多，批准文号：H20090296)，银杏叶提取物片( 金纳多)，上海国药集团化学试剂有限公司生产TTC(2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride)，德国默克公司生产的TUNEL 凋亡试剂盒，碧云天生物技术有限公司生产的bcl-2、Bax 抗体、ECL 显色试剂盒。仪器：日本Sony公司生产的Sony 数码相机，日本尼康公司生产的50i 荧光显微镜， Tanon 4500SF全自动数码凝胶化学发光图像分析系统和GIS 1D分析软件是由上海天能科技有限公司生产的。

1.2 方法

1.2.1 分组与动物建模 将40组大鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量组、高剂量组， 每组10只。取银杏叶，粉碎，用0.5%羧甲基纤维素钠溶解，合并提取液并且摇匀，配置为不同浓度，浓度5 g/L为低剂量组，浓度10 g /L为高剂量组，对大鼠的灌胃剂量为1 mL/100 g，1次/日，假手术组和模型组灌胃剂量为0.5%羧甲基纤维素钠，给药10 d，30 min后造模。依据Longa等[4]的大鼠大脑中动脉内栓线阻断法，对大脑进行阻塞，1 h后，再进行灌注，除假手术组的大鼠不进行插线栓塞外，各实验组其余处理方法一致，造模1 d后，断头取脑组织。

1.2.2 检测方法 ①bcl-2 和Bax 蛋白检测：每组取3只大鼠，检测方法采用Western blot方法，用剂量为10 mL/g组织裂解液裂解大鼠的脑组织，进行离心(4 ℃，14 000 r /min)，10 min后， 提取上清液，加入BCA 试剂盒进行蛋白定量，在100 ℃变性10 min，分装在-80 ℃保存，每孔20 μL，聚丙烯酰胺凝胶电泳(设定参数：恒定电流80 mA)后将聚丙烯酰胺凝胶转于PVDF膜上，洗涤后，用5% 脱脂奶粉封闭放置于室温环境1 h，再加入bcl-2和Bax抗体放于4 ℃环境过夜，第2天进行摇洗，再加入bcl-2和Bax抗体，继续放置于37 ℃环境1 h，再次洗涤后，进行ECL显影，最后利用图像分析软件对光密度条带值进行测定[5]。②细胞凋亡检测：4组各取4只大鼠，断头处死并解剖取出脑组织，严格按照TUNEL 凋亡试剂盒的操作步骤进行操作，用荧光显微镜进行观察，出现明亮绿色信号即为凋亡的细胞，每份标本取5个视野进行计数。③脑梗死体积百分比测定：每组取3只大鼠，在距离额极2 mm处向后取5个脑片，切取时注意等距离，放置于37 ℃避光的环境下进行TTC染色，持续10 min，染色后若是梗死的脑组织呈现白色，样本放置于10%甲醛固定24 h，照相机摄片后采用Tanon 4500SF全自动数码凝胶化学发光图像分析系统和GIS 1D分析软件计算脑梗死体积百分比[6]。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑缺血再灌注损伤后脑梗死体积百分比、凋亡细胞数比较 假手术组大鼠未发现脑梗死和凋亡细胞，模型组大鼠的脑梗死无论在体积百分比、凋亡细胞数都明显高于假手术组(P<0.05)；低剂量组、高剂量组梗死体积的百分比和凋亡细胞数明显少于模型组，且高剂量组大鼠脑梗死体积百分比、凋亡细胞数较低剂量组降低显著(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠脑缺血再灌注24 h 后脑梗死体积百分比、凋亡细胞数比较(±s)

1)与假手术组比较，P<0.05；2)与模型组比较，P<

0.05；3)与低剂量组比较，P<0.05

2.2 各组大鼠脑缺血再灌注24 h后bcl-2、Bax及bcl-2/Bax比较 模型组大鼠脑缺血再灌注24 h后bcl-2、Bax表达远高于假手术组(P<0.05)，低剂量组的大鼠脑缺血再灌注24 h后bcl-2、bcl-2/Bax显著高于模型组的大鼠，而Bax低于模型组的大鼠，高剂量组的大鼠脑缺血再灌注24 h后bcl-2、bcl-2/Bax表达高于模型组的大鼠，而Bax低于模型组，且高剂量组的大鼠脑缺血再灌注24 h后bcl-2/Bax高于低剂量组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠脑缺血再灌注24 h后bcl-2、Bax及bcl-2/Bax比较(±s)

1)与假手术组比较，P<0.05；2)与模型组比较，P<0.05；3)与低剂量组比较，P<0.05

3 讨 论

神经元死亡的主要表现为细胞凋亡，而细胞凋亡是由于脑缺血再灌注后所产生氧自由基、炎症因子诱发而引起的[7]。实验研究表明：脑缺血再灌注造模的大鼠神经细胞凋亡数较假手术处理的大鼠显著增多，且出现明显的梗死灶，差异具有统计学意义(P<0.05)。目前临床上关于脑缺血再灌注神经凋亡的发病机制尚未明确，但是在哺乳动物实验研究中发现，神经凋亡与bcl-2和Bax两个蛋白的表达相关，前者抑制神经细胞的凋亡，后者促进神经细胞的凋亡[8]。有研究显示：bcl-2蛋白在恶性肿瘤病人中表达显著，对临床上抗肿瘤治疗的效果产生影响，而Bax蛋白表达后膜相关蛋白能促进细胞的死亡，作用效果强烈，Bax蛋白表达后使得线粒体的通透性增加，进而释放Cytc 进入细胞质，Caspase-3被激活后造成细胞的凋亡，并且在细胞内bcl-2和Bax表达的两种蛋白相互作用形成的二聚体对线粒体的结构和功能具有调节作用，表现为抑制或者促进细胞的凋亡[9-10]。本实验结果显示：高剂量组大鼠的bcl-2/Bax值较模型组显著升高，提示银杏叶对于bcl-2、Bax表达具有显著的影响，可抑制神经细胞的凋亡，降低脑损伤，可能是由于银杏叶含有能够有效清除自由基，抑制脂质的氧化成分黄酮、银杏内酯类物质[11]。本实验显示：灌喂银杏叶提取物的大鼠脑梗死体积百分比、神经细胞凋亡数均显著下降，尤其是高剂量灌喂的大鼠梗死体积百分比、神经细胞凋亡数下降差异具有统计学意义(P<0.05)。在bcl-2、Bax表达方面，银杏叶灌喂的大鼠bcl-2表达增加，而Bax表达减少，但与剂量无关，高剂量灌喂的大鼠bcl-2/Bax值高于低剂量大鼠，高剂量灌喂银杏叶对于抑制神经细胞的凋亡作用更为显著，这与张鸿等[12]、牟芳芳等[13]学者的研究一致。

综上所述，银杏叶治疗缺血再灌注损伤大鼠能有效抑制神经细胞的凋亡、减少脑梗死体积百分比，高剂量用药更显著，可增加脑缺血再灌注24 h后bcl-2的表达，降低Bax表达，对脑缺血再灌注损伤起到保护作用，但是对于bcl-2和Bax表达与剂量无关。