胸腔积液中IL-33、ADA及外周血T-SPOT.TB联合检测对结核性胸膜炎的诊断价值

金芬华 王道会 林慧 彭燕平 何剑波 夏晓东

结核性胸膜炎是常见的一种肺外结核病。胸膜活检和细菌学检测是结核性胸膜炎诊断的金标准，但因胸膜活检的创伤性、结核杆菌培养困难等原因使诊断较为困难[1-2]。随着近年来酶学和分子生物学的不断发展，酶类及细胞因子在各种免疫性疾病的发病机制中越来越受到关注[3]。腺苷脱氨酶（adenosinedeaminase,ADA）存在于人体各组织，主要参与嘌呤核苷的分解，近年来临床上广泛用于结核病的诊断[4]。ADA检测是目前所公认的一种诊断结核性胸膜炎的理想指标[5]。结核感染T细胞斑点试验（tuberculosis T cell spot detection，T-SPOT.TB） 属于干扰素-γ 释放试验（interferon-γrelealseassay，IGRA）的一种。该法主要利用结核特异性抗原（EAST-6，CFP-10）通过酶联免疫斑点技术（enzymelinked immunospotassay,ELISPOT）检测结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）特异性抗原刺激外周血单个核细胞分泌干扰素 γ(interferon-γ，IFN-γ)的T细胞数,可作为结核病早期临床诊断的辅助方法[6-7]。研究显示在结核性胸膜炎患者胸腔积液中白介素（interleukin，IL）-33的水平明显高于其他病因引起的胸腔积液[8-10]。因此，我们推测IL-33可能在结核性胸腔积液（tuberculous pleural effusion，TPE）的产生中扮演重要角色。本研究通过分析胸腔积液中IL-33与ADA、外周血T-SPOT.TB的相关性，以及3者联合检测对结核性胸膜炎的诊断价值，旨在为临床诊断结核性胸膜炎提供参考，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2017年6月至2018年12月在本院呼吸内科住院的胸腔积液患者79例，其中男52例，女27例，年龄 16～89（48±20）岁。根据诊断结果分为两组，TPE 组 57例，男 41 例，女 16 例，年龄 16～89（39±18）岁；非TPE组22例（恶性胸腔积液17例，类肺炎性胸腔积液 5例），男 11 例，女 11 例，年龄 41～88（63±13）岁。两组患者性别比较差异无统计学意义（P＞0.05），年龄比较差异有统计学意义（P＜0.05）。纳入标准：（1）TPE：①胸腔积液检测到抗酸杆菌和（或）在胸膜活检样本中发现肉芽肿样改变者，并能排除其它原因所导致的肉芽肿性胸膜炎；②根据胸腔积液Light标准若符合渗出性改变，抗结核治疗，胸腔积液吸收，并且临床症状缓解。（2）非TPE：包括恶性胸腔积液和类肺炎性胸腔积液。①恶性胸腔积液：影像学结果符合原发性支气管肺癌并发胸腔积液；经纤维支气管镜或者胸腔镜取得的肺部组织活检其病理学确诊为肺癌；胸腔积液脱落细胞学检查检测到转移性肿瘤细胞。②类肺炎性胸腔积液：有咳嗽、咳痰和发热症状，且胸部影像学检查提示肺部渗出影，并经抗生素治疗后胸水吸收。排除标准：符合以下任意一项者，（1）患者在入院前半年内，罹患有胸部外伤者或接受关于创性胸膜腔检查治疗者；（2）患者曾接受过抗肿瘤或抗结核治疗；（3）患者使用过糖皮质激素、非甾体抗炎药，或免疫抑制剂者；（4）患者胸腔积液的病因诊断不明确者；（5）风湿免疫性疾病等导致的胸腔积液患者。本研究经温州医科大学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 胸腔积液患者住院经超声定位行胸腔穿刺置管术收集引流液5ml，与500U/ml的淡肝素混合，3 000r/min离心10min，收集上清液置于-80℃冰箱保存，待测定IL-33；收集引流液10ml送本院检验科化验室测定 ADA、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）。采集入选者外周晨起空腹肘静脉血5ml送本院检验科化验室进行T-SPOT.TB测定。

1.2.2 检测方法 胸腔积液中IL-33的测定采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法，试剂盒由英国abcam公司提供，操作步骤均严格按照说明书进行。ADA、LDH检测由本院检验科医师采用德国西门子AVDIA2400全自动生化仪协助检测完成。外周血T-SPOT.TB检测由本院检验科医师按照说明书严格操作，TB-IGRA培养管由厦门万泰凯瑞生物技术有限公司提供。

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0统计软件，符合正态分布的计量资料以表示；非正态分布的计量资料以中位数（四分位间距）表示，两组比较采用独立样本t检验。相关性分析采用Pearson相关。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线，最佳临界值依据约登指数（敏感度+特异度-1）确定。计算IL-33水平对结核性胸膜炎的最佳诊断阈值及相应的敏感度和特异度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者胸腔积液中IL-33、ADA、LDH水平和外周血T-SPOT.TB水平比较 见表1。

表1 各组患者胸腔积液中IL-33、ADA、LDH和外周血T-SPOT.TB水平比较

由表1可见，TPE组患者胸腔积液中ADA、IL-33及外周血T-SPOT.TB水平明显高于非TPE组患者，差异均有统计学意义（均 P＜0.01）。

2.2 胸腔积液中IL-33水平与ADA水平、外周血TSPOT.TB水平的相关性分析 见图1、图2。

图2 胸腔积液中IL-33水平与外周血T-SPOT.TB水平的相关性分析散点图

由图1、2可见，胸腔积液中IL-33水平与ADA、外周血 T-SPOT.TB 水平均呈正相关 （r=0.343、0.450，均P＜0.05）。

2.3 胸腔积液中ADA、IL-33和外周血T-SPOT.TB水平对结核性胸膜炎的诊断价值 见表2、图3。

表2 胸腔积液中IL-33、ADA和外周血T-SPOT.TB对结核性胸膜炎的诊断价值

图3 胸腔积液中ADA、IL-33和外周血T-SPOT.TB对结核性胸膜炎诊断的ROC曲线

由表2、图3可见，胸腔积液中IL-33、ADA水平和外周血 T-SPOT.TB诊断 TPE 的 AUC分别为 0.753、0.912 和 0.865，灵敏度分别为 49.1%、93.0%和 92.3%，特异度分别为 100.0%、90.9%和 71.4%。

2.4 胸腔积液中 IL-33、ADA和外周血 T-SPOT.TB 3者联合检测对结核性胸膜炎的诊断价值 见表3。

表3 胸腔积液中IL-33、ADA和外周血T-SPOT.TB 3者联合检测对结核性胸膜炎的诊断价值

由表3可见，胸腔积液IL-33、ADA和外周血TSPOT.TB 3 者联合检测时 AUC 最大，为 0.962，特异度100.0%，灵敏度 88.5%。

3 讨论

结核性胸膜炎是导致胸腔积液的最常见病因，占我国胸腔积液住院患者病因的 49.5%～54.5%[11]。临床医生需要一种快速有效的检测方法，以便早期诊治TPE患者，减少因TPE所致的结核性脓胸、肺毁损等并发症[12]。

IL-33由Schmitz等[13]2005年证实，属于IL-1类细胞因子超家族新成员，具有家族成员相似的同源性结构三叶草形结构。本研究结果显示，结核性胸膜炎患者胸腔积液中IL-33水平明显高于非TPE，TPE中IL-33的AUC 为 0.753，以 155.96ng/L为最佳截断值时灵敏度为49.1%，特异度为100%。胸腔积液中IL-33水平与ADA、外周血T-SPOT.TB均呈正相关。Lee和Xuan等[9-10]发现，结核性胸膜炎患者胸腔积液中IL-33水平明显高于其他病因积液和自身血清水平，其灵敏度分别为78%和86.96%，特异度分别为65%和90.48%。与本研究类似，Lee等[9]的研究结果提示胸腔积液中IL-33水平与ADA呈明显正相关。Li等[8]的研究也显示，IL-33诊断结核性胸膜炎的灵敏度为83.9%，特异度为87.3%，AUC为0.823。所以，以上证据显示，与非TPE相比，IL-33与TPE的病理生理更有相关性。虽然我们没有明确IL-33对TPE发病的具体作用机制，但本研究所观察到的IL-33与结核性胸膜炎之间的关系可以通过以下假设来解释：IL-33在一定程度上有免疫调节效应，如诱导细胞因子和应答细胞。越来越多的基础研究显示，IL-33可以通过增加IFN-γ参与调解增强Th1细胞免疫反应[14-16]。研究还发现，IL-33的表达由IFN-γ和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）上调[17-18]。因此，IFN-γ不只是IL-33的上游调节因子，同时也是IL-33信号的下游产物[15-16，19]。所以，在结核性胸膜炎中IL-33和IFN-γ可能形成偶联的正反馈回路[15-20]。所以，IL-33可能参与结核性胸膜炎的发病和发展，其水平升高可能为结核杆菌在胸膜局部刺激的作用，IL-33对结核性胸膜炎的诊断具有重要应用价值。

ADA是嘌呤核苷代谢的一种重要酶类，主要存在于人体各组织，特别是淋巴细胞中。结核性胸膜炎发病机制是MTB感染引起机体产生迟发型超敏反应，MTB的结核蛋白进入胸膜腔引起胸膜炎症反应，导致淋巴细胞分化增殖，引起ADA含量升高[4]。ADA是最广泛研究和推荐的生物标志物之一，并且已经发现其在诊断TPE方面具有良好的性能。一篇包含63项研究的荟萃分析评估了胸腔积液中ADA活性在鉴别TPE和非TPE的价值，证明了其高灵敏度和特异度（分别为92%和90%）[21]。本研究结果显示，结核性胸膜炎患者胸腔积液中ADA水平明显高于非TPE，其诊断结核性胸膜炎灵敏度为93.0%，特异度为90.9%，与Meta分析研究中ADA特异度（90.0%）相似[21]。

结核性胸膜炎的主要免疫方式是细胞免疫，T细胞在受到MTB抗原刺激后,活化分泌细胞因子IFN-γ参与免疫应答，患者外周血中存在对应的特异T细胞[22]。T-SPOT.TB检测的原理是通过分离外周血MTB特异性T细胞，经体外培养和抗原再次刺激后分泌IFN-γ,以相应抗体检验IFN-γ浓度来诊断是否存在MTB感染。据文献报道，其诊断价值不受患者性别、年龄、肿瘤、免疫抑制等影响，不仅可用于肺外结核病的诊断，还可以作为治疗效果评估，具有较高的应用价值[23]。本研究结果显示，MTB组的外周血T-SPOT.TB水平明显高于非MTB组，外周血T-SPOT.TB对TPE的灵敏度为92.3%，特异度为71.4%。但研究显示外周血T-SPOT.TB存在自身缺陷，易受外周血T淋巴细胞数量的影响[24]，尤其是免疫缺陷的胸腔积液患者[25]，常会出现假阴性结果。且外周血 T-SPOT.TB不能鉴别MTB潜伏感染还是活动性结核病，致使诊断活动性结核病的特异度受限制。

综上所述，本研究发现IL-33的特异度最高，为100.0%，对于排除结核性胸膜炎的意义重大，但灵敏度不高，只有 49.1%。然而，IL-33联合 T-SPOT.TB 检测诊断特异度为100.0%，灵敏度升高，为76.9%。联合IL-33+ADA+T-SPOT.TB检测诊断特异度为100.0%，灵敏度为88.5%，提示联合检测对结核性胸膜炎具有更高诊断价值，有利于早发现、早治疗，对结核性胸膜炎有重要的辅助诊断价值。