姜黄素对NOD糖尿病小鼠Th1细胞和CD4+Treg细胞的作用

王弘珺 李质馨 刘忠平 刘玮健 刘洋 田洪艳

(吉林医药学院基础医学院，吉林 吉林 132013)

姜黄素(Curcumin)属于多酚类化合物，取自姜黄根部，为天然成分，无毒性作用。姜黄素对乳腺癌、直肠癌、胰腺癌有治疗作用，此外还可治疗多种自身免疫性疾病，如炎性肠病、类风湿关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎、重症肌无力等〔1～4〕。其作用机制为降低炎性细胞因子白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素(IFN)γ，升高抑炎性细胞因子IL-4和IL-10，调节淋巴细胞和巨噬细胞的活化与功能〔5〕。1型糖尿病是T细胞进行性损伤胰岛β细胞引起的自身免疫性疾病，存在CD4+T细胞亚群的分化失衡〔6,7〕。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是1型糖尿病的动物模型，发生糖尿病早期，NOD小鼠的Th1细胞进行性增加、CD4+Treg细胞相对缺乏〔8〕。本文研究姜黄素对NOD小鼠Th1细胞和CD4+Treg细胞的作用，探讨其对1型糖尿病的治疗作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级10周龄雌性NOD小鼠购自北京华阜康生物公司，随机分为对照组和姜黄素组，每组6只，分别给予溶剂或姜黄素(50 mg/kg体重)灌胃，间隔1 d，至第20周。

1.2试剂 抗CD3-PE/CY7抗体、抗CD4-PERCP抗体、抗CD8-PB抗体、抗IFNγ-APC抗体、抗CD25-PE抗体、抗小鼠FcR单抗(BioLegend公司)，细胞活化试剂盒、蛋白转运抑制剂GolgiStop、CD4+T细胞MACS分选试剂(BioLegend公司)，抗Foxp3-AF488抗体及染色试剂盒(eBioscience公司)，细胞因子染色试剂盒(BD公司)，BrdU ELISA检测试剂盒(Roche公司)，小鼠淋巴细胞分离液(Sigma公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司)、RPMI1640培养基(Hyclone公司)。

1.3血糖检测 取10 μl小鼠尾静脉血，用血糖仪测定血糖，血糖值≥11.1 mmol/L为高血糖。

1.4外周血单个核细胞的分离 取小鼠静脉血100 μl，肝素抗凝，用900 μl磷酸盐缓冲液稀释静脉血。在15 ml离心管中加入1.0 ml淋巴细胞分离液，将稀释后的血液平铺在分离液上。室温2 000 r/min离心20 min。离心结束后收集中间层细胞，与等体积磷酸盐缓冲液混匀，室温1 500 r/min离心5 min，弃上清，重复洗涤细胞1次，悬浮于含10%FBS的RPMI1640培养液中。

1.5组织细胞样品的制备 麻醉小鼠取脾和胸腺，制单细胞悬液，用红细胞裂解液(17 mmol/L Tris-HCl，140 mmol/L NH4Cl，pH7.2)裂解红细胞，悬浮于10%FBS的RPMI1640培养基中，计数。

1.6细胞因子检测 取1×106淋巴细胞，加入终浓度为50 ng/ml佛波酯(PMA)、500 ng/ml Ionomycin和4 μl/ml GolgiStop，置于37℃、5%CO2培养箱中培养4 h，收集细胞。加抗FcR单抗、抗CD3-PE/CY7抗体、抗CD4-PERCP抗体，4℃染色30 min。参照BD说明书进行抗IFNγ-APC抗体染色，流式细胞仪进行分析。

1.7Foxp3的检测 取1×106淋巴细胞，加入抗FcR单抗、抗CD3-PE/CY7抗体、抗CD4-PERCP抗体、抗CD8-PB抗体、抗CD25-PE抗体，4℃染色30 min。参照eBioscience说明书进行抗Foxp3-AF488抗体染色，流式细胞仪进行分析。

1.8CD4+Treg细胞抑制功能检测 先用BioLegend试剂盒分离小鼠脾CD4+T细胞，再用抗CD3-APC抗体、抗CD4-PERCP抗体、抗CD25-PE抗体、4℃染色30 min，流式细胞仪分选CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-T细胞。在96孔板中加1 μg/ml抗CD3抗体(包被)和2 μg/ml抗CD28抗体(溶解)，接种对照组CD4+CD25-T细胞(5×104细胞/孔)，分别接种对照组或姜黄素组CD4+CD25+Treg细胞(1.25×104细胞/孔)，于37℃、5%CO2孵箱中培养72 h，用BrdU ELISA法检测细胞增殖，酶标仪测吸光度(OD)值。

1.9统计学处理 应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1血糖水平 从第14周开始每周测小鼠血糖，结果见图1。第20周时，对照组血糖正常小鼠的百分数为20%；而姜黄素组血糖正常小鼠的百分数为60%。

图1 两组血糖正常小鼠

2.2外周血Th1细胞和CD4+Treg细胞的流式检测 姜黄素组Th1细胞比例显著低于对照组(P<0.05)。两组CD4+Treg细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。姜黄素组CD4+Treg/Th1显著高于对照组(P<0.05)。见表1，图2。

表1 外周血Th1细胞和CD4+Treg细胞变化

与对照组比较：1)P<0.05；下表同

2.3胸腺CD4+Treg细胞的流式检测 两组胸腺CD4+CD8-T细胞、CD8+CD4-T细胞及CD4+Treg细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)；姜黄素组胸腺总细胞数显著高于对照组(P<0.05)，见图3，表2。

2.4CD4+Treg细胞抑制功能检测 姜黄素组CD4+CD25+Treg细胞可抑制对照组CD4+CD25-T细胞增殖(0.414±0.055 vs 0.639±0.077，P<0.01)；但对照组CD4+CD25+Treg细胞(0.626±0.052)不能抑制自身CD4+CD25-T细胞增殖。

表2 胸腺内CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD4+Treg细胞变化

3 讨 论

引起1型糖尿病的重要免疫因素是CD4+T细胞亚群的分化失衡。前期研究表明，糖尿病早期外周Th1细胞及其细胞因子IFNγ增加，而外周CD4+Treg细胞数目或功能相对降低，从而导致糖尿病〔8～10〕。针对1型糖尿病早期CD4+T细胞亚群分化失衡，应用药物抑制Th1细胞分化、促进CD4+Treg细胞分化、增加CD4+Treg细胞抑制功能，可阻止或改善1型糖尿病病情。

由于雌性NOD小鼠在12～30周龄时自发糖尿病，本研究对雌性NOD小鼠从第10周至第20周用等体积溶剂或姜黄素灌胃，结果提示，姜黄素早期治疗推迟了糖尿病NOD小鼠的高血糖症状。

本研究结果说明，姜黄素降低NOD小鼠外周Th1细胞数目，相对缓解外周CD4+Treg细胞缺乏，延缓了NOD小鼠的高血糖症状。天然CD4+Treg细胞产生于胸腺，姜黄素对NOD小鼠胸腺内CD4+Treg细胞未见明显影响，然而，姜黄素延缓胸腺退化，改善了NOD小鼠的胸腺环境。姜黄素是否影响胸腺内T细胞分化或胸腺上皮细胞及胸腺树突细胞功能，还需深入研究。进一步分析姜黄素对CD4+Treg细胞的作用，对照组CD4+CD25+Treg细胞不能抑制自身CD4+CD25-T细胞对抗CD3和抗CD28的增殖反应；然而姜黄素组CD4+CD25+Treg细胞可以抑制对照组CD4+CD25-T细胞或姜黄素组CD4+CD25-T细胞对抗CD3与抗CD28的增殖反应，说明姜黄素组CD4+Treg细胞的抑制功能明显增加。PTEN-mTOR与IL-2-STAT5信号是调控Th1细胞和CD4+Treg细胞分化、维持CD4+Treg细胞抑制功能的关键信号〔11～15〕。姜黄素是否调控上述两个信号通路影响CD4+Treg细胞分化与功能，尚需深入研究。

综上，姜黄素治疗NOD小鼠，可降低外周血Th1细胞，增加CD4+Treg细胞抑制功能，延缓胸腺退化，降低NOD小鼠高血糖的发生率。