肝素结合蛋白在感染中的应用及研究进展

赵芳丽 乔莉娜

感染是指病原菌(如：细菌、病毒、真菌等)侵入机体，并在机体内生长、繁殖，导致机体正常组织防御功能受损，从而引起组织损伤性病变和全身性炎性反应。随着环境污染、社会压力的增加，感染性疾病是引起人们机体受损的常见原因之一。全球疾病负担研究(the global burden of disease study，GBD)显示，在全球范围内，2017年残疾调整寿命年(disability-adjusted life-years，DALYs)的前五大主要原因是感染性疾病(下呼吸道感染、疟疾、腹泻、艾滋病和结核)和新生儿疾病[1]。当机体防御功能下降(如：免疫缺陷、恶性肿瘤等)，感染不仅容易发生，且容易加重为严重感染和感染性休克。20%～30%的严重脓毒症患者在入院时没有出现器官功能障碍的迹象，而是在急诊评估后的第一个24 h内进展为严重脓毒症[2]。且严重感染和感染性休克的病死率一直高居不下，达30%～50%[3]。因此，可以快速判断疾病严重程度，预测疾病发展趋势及预后的生物标志物对临床危重症的诊治及降低病死率具有重大意义。

1 肝素结合蛋白的结构、产生及作用机制

1.1 肝素结合蛋白的结构 肝素结合蛋白(heparin-binding protein，HBP)是一种由中性粒细胞衍生的无活性的丝氨酸蛋白酶同源物。早在1949年，HBP被分离并定义，1991年，发现其具有极强的结合肝素能力，将其命名为肝素结合蛋白。HBP是一种相对分子量为37 000的颗粒性糖蛋白，由222个氨基酸组成，也称为CAP37/azurocidin，其属于中性粒细胞阳离子蛋白serprocidin家族成员；该家族还有另外3个成员：HBP亲近组织蛋白酶G、中性粒细胞弹性蛋白和蛋白酶3。

1.2 肝素结合蛋白的产生 HBP预先贮存在嗜中心粒细胞的分泌囊泡及嗜天青颗粒中。当中心粒细胞被激活时，前者可通过快速的胞吐作用或通过与中心粒细胞表面的β2整合素结合而释放HBP；嗜天青颗粒的胞吐能力低，仅在中性粒细胞外渗到组织后释放HBP。感染发生时，病原体与相应的受体结合，趋化因子(如IL-8)从感染部位释放[4]，激活中性粒细胞，并诱导HBP释放。另外，细菌蛋白质也可以直接激活中性粒细胞，释放HBP[5]。这些细菌蛋白包括来自金黄色葡萄球菌的酚可溶性调节蛋白[6]、来自化脓性链球菌的M1蛋白[5]和来自猪链球菌的溶血素[7]。而HBP是中性粒细胞分泌囊泡分泌到环境中的惟一颗粒蛋白。这就是细菌被吞噬30 min后总HBP被释放80%的原因，内环境中HBP的比例远远超过其他中性粒蛋白[4]。

1.3 肝素结合蛋白的作用机制 当中性粒细胞与内皮表面的黏附分子接触时，中性粒细胞被激活并释放HBP；被释放的HBP与内皮上的糖胺聚糖结合，导致选择性蛋白激酶C(PKC)和Rho激活酶活化，以及钙离子内流，引起内皮细胞骨架重组、细胞收缩变形，形成细胞间隙，导致内皮细胞屏障功能破坏、血管通透性增加，液体外流形成水肿和大分子外排增加[8]。循环中的白细胞通过破坏的内皮屏障外渗至感染部位。另外，HBP可靶向作用于内皮细胞中的线粒体，降低线粒体的膜电位[9]线粒体功能障碍是败血症诱发器官功能衰竭的重要作用因素[10]。HBP由中性粒细胞产生，亦可作为中性粒细胞的化学趋化因子，使更多中性粒细胞迁移至组织的感染部位；此时，大量(74%)贮存在嗜天青颗粒中的HBP被释放到机体组织中，对多种细胞产生作用。HBP是一种多功能蛋白。首先，它可以趋化、激活单核/巨噬细胞，增加氧自由基的形成和释放，起到杀菌作用；其次，可以通过旁分泌的形式结合特异的膜受体，激活并诱导单核/巨噬细胞合成和释放非特异性的炎性因子，部分调节炎症过程[11]；另外，HBP可以诱导组织中成纤维细胞的迁移，在炎性反应的调节和伤口的愈合中起作用[12]、诱导平滑肌细胞的迁移促进动脉粥样硬化的形成及发育[13]和角膜上皮细胞迁移[14]。然而，HBP引起这些细胞迁移的原因和机制尚不清除。最后，Fisher等[15]在研究中发现HBP还可诱导肾近端小管上皮细胞产生的IL-6的活化。

2 肝素结合蛋白在各系统、不同感染中的研究进展

2.1 HBP与呼吸系统 HBP通过与血管内皮上的糖胺聚糖结合黏附在肺微血管内皮单层细胞上，引起内皮细胞骨架重组，血管渗透性增加[8]，大量白细胞及液体外渗至肺组织；在病原菌产物、烟雾等有害物质(如NO2)刺激下，巨噬细胞向肺组织迁移并释放多种细胞因子，如：TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1等；反过来这些细胞因子又可趋化中性粒细胞、T细胞、嗜酸性细胞等向肺组织迁移、聚积，这些细胞和炎性细胞因子是引起气道炎症慢性化和气道严重损伤的重要因素。 研究证实HBP在肺部的聚积可诱导肺损伤；而从消耗中性粒细胞则可以完全消除了肺损伤，所以不论是急性肺损伤还是输血相关肺损伤，血HBP浓度均明显升高，可用来预测发生肺损伤的高风险患者[16]。另有研究指出血HBP水平在脓毒症相关的ARDS患者及创伤后ARDS患者中亦呈现较高水平，且发现入院48 h内患者的HBP值对脓毒症相关ARDS的预测价值最高，最佳临界值为28.56 ng/ml[17]。而另一项纳入278位(33人确诊ARDS)入住ICU患者的前瞻性研究却得出了相反的结果：发现入院时血浆HBP的浓度与ARDS的发生无相关性。虽然分析原因可能是未将胸片作为每日常规检查，使ARDS患者漏掉，但HBP在其中的价值确实值得商榷[18]；在近期针对AECOPD患者的研究发现，HBP有较高的诊断价值，特别是对痰培养阴性且临床高度怀疑细菌感染AECOPD患者，血浆 HBP 水平比 PCT 更有抗生素应用指导意义[19]。不论在肺炎合并脓毒症时，还是在呼吸机相关性肺炎时，血HBP较PCT均有更好的预测价值[20,21]。另有一组单中心前瞻性研究对179例胸腔积液患者胸腔积液的HBP水平进行检测后发现，当HBP的截断值为62.9 ng/ml时针对肺炎旁胸腔积液的诊断效能高，且明显优于传统的胸腔积液LDH、ADA、和TP水平，可作为一个新的标志物辅助胸腔积液鉴别诊断[22]。对于矽肺并发重症感染患者中，HBP在矽肺三期中的AUC分别为0.932、0.977、0.964，高于WBC、CRP、PCT，有望成为矽肺重症感染患者筛查及病程分析的检查标志物[23]。支气管扩张症是呼吸内科常见疾病，主要致病因素为支气管感染、阻塞和牵拉。Abo-Leyah等[24]对经胸部CT确诊为支气管扩张的121例患者进行了长达3年的随访后，并对他们痰上清液中的HBP浓度进行研究后认为，HBP可作为判断支气管扩张患者气道炎症和疾病严重程度的潜在生物标志物，同时指出HBP高于人群中位数与第一次住院和病情恶化的时间较多有关。

2.2 HBP与心血管系统 随着人口老龄化的发展，心血管系统疾病的发病率和病死率在我国有逐年上升的趋势，威胁着人们的生命健康，也给社会带来沉重的经济负担；其中，急性心肌梗死是心血管疾病最主要的死亡原因之一。而炎性反应在急性心肌梗死的发生发展中起着重要作用。一项针对STEAMI的预测及预后的对照研究表明，认为HBP可作为预测STEAMI的敏感指标，且HBP水平越高，预示着患者的预后越差。而以临界值8.55 ng/ml为标准采取积极有效的措施则可降低病死率[25]。HBP参与了多种炎症过程，且可诱导平滑肌细胞的迁移促进动脉粥样硬化的形成及发育；另外，单核细胞在冠状动脉粥样硬化中起重要作用，而HBP可以趋化、诱导单核细胞活化，释放炎性因子[26]，破坏或侵袭硬化斑块，引起急性冠脉综合征。升高的HBP水平是心脏骤停后器官功能衰竭的早期指标，且心脏骤停后6 h和12 h血浆HBP水平显著升高的患者预后不良[27]。Pan等[28]研究了心脏手术后并发心肌损害相关心源性心衰(myocardial injury-related cardiogenic shock，MIRCS)时血浆HBP的变化情况，指出血浆HBP是MIRCC的独立危险因素，与肌钙蛋白(cTnT)呈正相关。另有关于急性动脉夹层的研究指出血浆HBP阴性值对急性动脉夹层(AAD)早期筛查价值大，且HBP水平越高，AAD患者预后越差。急性肠系膜血管缺血性疾病主要是肠系膜动静脉栓塞、血栓形成，继发与低血流量状态的血管收缩，其中肠系膜上动脉栓塞最常见(占40%～50%)。高通等[29]通过动物实验表示血浆HBP水平在肠系膜缺血的第6小时与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),认为血浆HBP水平在急性肠系膜血管缺血模型中升高较慢,不过,但该研究选用的动物模型数量偏少(n<40),仍需进行大量的临床研究。

2.3 HBP与泌尿系统 多项针对尿路感染的研究指出，尿HBP可作为对成人及儿童尿路感染的最佳诊断标志物，不同的是成人的尿HBP截断值为69.2 ng/ml[30]，而儿童的最佳截断值则是>32 ng/ml[31]这2组研究差异(成人的尿HBP截断值比儿童高2.16倍)发生的原因可能是小儿机体防御能力弱，少量的炎性因子释放即可产生比成人更明显的炎性反应。然而在区分老年人无症状菌尿和尿路感染方面，尿HBP表现出比较差的特异性；但对老年人的症状性尿路感染，尿HBP具有较高的阴性预测值[32]。目前关于脓毒症诱发急性肾损伤的机制，并不十分清楚，多数认为与血管渗漏/灌注不足、局部肾小管炎症和细胞周期停滞的组合有关。并发现血浆HBP水平升高与急性肾损伤(AKI)发展风险增加有关[33]。考虑原因可能与HBP可能通过增加肾血管通透性(诱导肾小管上皮细胞产生IL-6，诱导炎性反应)和肾水肿(液体外流、水肿形成)直接损伤肾组织，改变肾小球滤过和肾小管的功能[34]有关。非泌尿系统感染所致脓毒症患者的血浆HBP水平明显升高、但尿HBP水平不一定升高，提示尿路感染患者在该局部感染灶存在中性粒细胞的活化。尿路结石是泌尿系统常见疾病，且上尿路结石发生概率大于下尿路；刘俊肖等[35]通过对64例上尿路感染性结石患者血浆HBP水平研究，认为HBP在上尿路感染性结石的预测中具有良好的真实性，对经皮肾镜手术前抗生素的应用具有指导意义。另有一组针对腔内碎石术后并发尿脓毒症的研究指出，血浆HBP可作为术后尿脓毒血症的早起诊断指标，且其诊断效能优于PCT、CRP，以及白细胞计数[36]。

2.4 HBP与脓毒症 脓毒症是由感染引起的机体反应失调导致器官功能障碍；脓毒症休克则是脓毒症的一种表现形式——指在脓毒症基础上，合并有明显的循环和细胞代谢异常，与白细胞的活化、内皮细胞损伤和血管通透性增高相关，病死率显著高于一般脓毒症。全球疾病负担研究指出，2017年全球范围内有11万例脓毒症相关死亡，占全球死亡总数的19.7%。脓毒症的早期识别及疾病的预测至关重要[37]。多项前瞻性多中心研究及荟萃分析证实血浆HBP是诊断及预测疾病进展、发生感染相关器官功能障碍较好的生物标志物,其敏感性和特异性优于PCT、CRP、WBC及LAC等；且随着血浆HBP水平增加，危重感染的风险增加[38-40]。新生儿作为一个特殊群体，免疫系统发育不完善，抵御感染的能力低下，脓毒症在新生儿的致死率高达11%～19%[41]，早期识别新生儿脓毒症并积极治疗对降低新生儿病死率显得尤为重要。邓永超等[42]将92例新生儿分成一般脓毒症(37例)、严重脓毒症(39例)和脓毒症休克(16例)，对3组间的血浆HBP、PCT及hs-CRP进行了比较后发现，严重脓毒症组及脓毒症休克组的血浆HBP水平显著高于一般脓毒症，而PCT及hs-CRP在3组间差异无统计学意义(P>0.05)，且HBP诊断新生儿脓毒症的曲线下面积大于PCT及hs-CRP，认为血浆HBP在新生儿脓毒症的早期诊断以及脓毒症分级方面有指导价值，且优于PCT及hs-CRP；另有一项针对小儿脓毒症的研究指出，血浆HBP在脓毒症被诊断前的72 h已开始升高，直到诊断前24 h才被PCT升高替代，认为HBP具有较宽的诊断窗口，可作为早期预测指标之一[43]。这两项研究说明血浆HBP对儿童脓毒症的早期诊断有预测、指导意义；但儿童方面的研究偏少，可作为后期研究的方向。 另外，发热患者血浆HBP水平升高与短期病死率增加显著相关—血浆HBP水平高于建议截断值(15 ng/ml)的患者28 d病死率增加4倍；且随着时间逐渐下降的血浆HBP浓度提示较好的预后[4]。但另一项研究指出血浆HBP水平作为创伤后败血症的早期生物标志物的辨别特性差[44]。生命器官组织微循环灌注不足是多数休克共同的发病基础。HBP可介导血管通透性增加，液体及大分子物质外流，可能参与了休克的发生。多项针对脓毒症休克患者研究发现HBP可能是诱发脓毒性休克的重要介质，且血浆HBP浓度与休克严重程度呈正相关；还发现脓毒性休克和其他原因导致的休克患者，HBP浓度无差异，说明血浆HBP的浓度高低与疾病本身无关、与疾病的严重程度相关[38]。肖薇薇等[45]通过动物模型研究，认为血浆HBP脓毒随着大鼠脓毒症严重程度增加而增加,而且指出抗生素的应用可以减轻血浆HBP的含量,具有临床推广应用价值。

2.5 HBP与其他感染 HBP是一种多功能蛋白，它参与了多种炎性反应。急性细菌性脑炎是一种严重的中枢神经系统感染性疾病，成人及儿童均易发病。脑脊液病原菌培养是确诊细菌性脑膜炎的金标准。然而，抗生素的使用降低了微生物培养的准确率，Kandil等[46]在HBP对急性细菌性脑膜炎诊断的临床研究中发现，即使在使用过抗生素治疗的急性细菌性脑膜炎患者中，血浆HBP及脑脊液HBP均显著升高，为临床诊断及治疗提供依据。另有多项针对急性细菌性脑膜炎的研究指出，血浆HBP在诊断及区分急性细菌性脑膜炎和中枢神经系统其他病原的感染时均有较理想的表现；且脑脊液HBP的升高程度与疾病严重程度及预后相关[47,48]。重症胰腺炎病情进展迅速，治疗困难且病死率高；合并细菌感染时，病死率会上升至少3倍。多项在急性重症胰腺炎继发感染的研究中也指出血浆HBP可作为诊断指标，且联合PCT及IL-8共同检测，可降低重症胰腺炎继发感染误诊及漏诊的发生[49,50]。邱飞等[51]将142例重症胰腺炎患者分成2组，继发细菌感染组68例，未继发细菌感染组74例，同时比较了2组血浆HBP及PCT，结果表示重症胰腺炎继发细菌感染组血浆HBP水平及PCT值均显著高于对照组(P<0.05)，HBP与PCT呈正相关性，且HBP的ROC曲线下面积(0.93)大于PCT的ROC曲线下面积(0.8)，认为血浆HBP更有利于评估重症胰腺炎继发细菌感染，可作为临床指导临床抗生素选择的指针。丹毒是由溶血性链球菌引起的浅表皮肤的感染，表现为皮肤的强烈炎症，伴有皮肤组织的水肿及疼痛的红斑；链球菌M1蛋白可激活中性粒细胞，释放HBP，诱导炎性反应。一项对12例单侧下肢丹毒患者进行研究，发现HBP存在于从感染和红斑出获得的皮肤活检中、而健侧肢体均未检测到HBP；考虑HBP可能与感染皮肤的水肿形成有关[4]。史克礼[52]通过对36例恶性肿瘤患者早期细菌感染的患者进行对照研究后指出，血浆HBP在这些患者中有较高的敏感度(91.67%)和特异性(80.56%)，当联合PCT时诊断的敏感度(97.22%)和特异性(83.33%)更高，临床值得推广。在60例急性盆腔炎患者的临床研究中发现血浆HBP水平在细菌感染组的水平明显高于非细菌感染组(P<0.05),且随着细菌感染组疾病的严重程度增加而显著增高，认为HBP不仅可以作为细菌感染性急性盆腔炎诊断及鉴别诊断的生物标志物,还可以用于判断病情的严重程度,也可作作为评估治疗效果的依据[53]。HBP作为一种多功能蛋白，在多中疾病都显示了较好的预测及指导价值，但这些疾病的病原菌多系细菌感染；近日国内有一项关于血浆HBP在儿童流感方面的研究，对169例单纯病毒性流感患儿及31例病毒性流感合并细菌感染的患儿进行对比发现，病毒性流感合并细菌感染组血浆HBP水平显著高于单纯病毒性流感患儿(P<0.01),敏感度及特异性分别为0.98、0.94；同期进行比较的PCT及CRP在2组间无统计学意义，认为HBP在病毒性流感合并细菌感染组有较高的早期诊断价值，对临床医师在病毒性流感时抗生素的选择有一定的指导意义[54]。

3 肝素结合蛋白与靶向治疗

血管通透性适度增加是正常炎性反应过程的一部分；然而，过度增加的血管通透性可导致有效循环血容量减少，肺泡中液体聚积及循环的不稳定性。HBP是PMN导致血管通透性改变的主要介质，是内皮细胞渗透的强诱导剂，在增加血管渗透方面起着重要作用[55]；减少HBP的释放可能降低HBP介导的血管通透性的增加；HBP可作为治疗脓毒性休克、ARDS及其他有血管渗透性增加疾病的新的研究方向。HBP由中性粒细胞产生，抑制中性粒细胞的活化也可阻止HBP介导的血管通透性的增加；但中性粒细胞在免疫应答中起着许多重要的作用，抑制/阻断中性粒细胞活化可能引起其他不良反应；故靶向干预HBP及其受体的相互作用可能效果更好。HBP是一种阳离子蛋白，聚阴离子的硫酸葡聚糖可完全阻止HBP对内皮通透性的影响。HBP可通过诱导选择性蛋白激酶C和rho激活酶途径的活化增加内皮通透性；非选择性蛋白激酶C抑制剂和rho激酶抑制剂也可减弱HBP诱导的通透性的增加。肝素是一种与HBP结合的多功能带负电荷的糖胺聚糖；普通肝素和低分子肝素在体外和小鼠模型中均阻断了HBP诱导的内皮通透性、阻断了HBP的线粒体作用和HBP诱导诱导的肾小管上皮细胞对IL-6的释放[56]。有荟萃分析指出肝素治疗可降低脓毒性休克的死亡率，这可能是其产生治疗作用的重要机制[57]。另外，β2整合蛋白拮抗剂和肽Gly-Pro-Arg-Pro也可阻断链球菌M1蛋白诱导的HBP的释放[4]。内皮素-1受体抑制剂在猪内毒素血症模型中也表达出了对HBP水平的抑制及HBP介导的通透性的降低[58]。 中性粒细胞是病原体入侵宿主后最早被募集的细胞；HBP预先贮存在中性粒细胞的分泌囊泡中，是最先被动员且惟一被释放到环境中的颗粒蛋白，在血管渗透及水肿形成方面起着重要作用。健康人血中的HBP水平很低，一般不超过10 ng/ml。但当感染发生时，HBP水平会随着病情的严重程度变化；多项研究指出HBP与多种感染有关，在多种感染中均有升高，且认为在预测重症感染及感染性休克的发生发展及预后有较好的价值；可以作为临床快速判断危重病情的有效生物指标；有待继续深入研究。