Six1在恶性肿瘤中的最新研究进展

姚昌洋，姜芳倩，潘成武，李煊赫，孙思雨，姚廷敬

同源盒基因Six1是一多基因家族的转录调节因子，与恶性肿瘤的发生发展相关。异常表达的Six1基因可以通过多种信号通路导致正常细胞的凋亡与增殖失衡，上游调控因子的异常表达可以导致Six1的功能失调，而异常表达的Six1可以作用于其靶基因CyclinA1、TGF-β等，从而促进肿瘤的发生发展。

1 同源盒基因基本概述

同源盒基因是一组特定时间表达的转录调控因子，可特异性调节基因的表达，其在结构上具有高度的保守性，可以特异性的识别并结合DNA结构域，其大小及氨基酸的结构顺序是固定的，称为同源异型结构域(honedomain,HD)[1]。根据氨基酸序列进行分析，Six家族可以分为三个亚系，共六个亚型，Six1/Six2、Six3/Six6、Six4/Six5，而对其亚型之一的Six1研究较多，其定位于人类染色体14q23上，是一段183bp的保守DNA编码基因序列，可以编码60-61个氨基酸，它参与细胞的增殖与分化，并在细胞的黏附及迁移中起到关键作用[2]。目前已经有研究表明，Six1基因能在较多的恶性肿瘤中表达，并在肿瘤的发生、发展中发挥作用[3]，但对于在肿瘤进展过程中Six1具体通过何种调节机制、如何产生作用并无确切的解释，后续的研究可能会更加集中在如何调控表达异常的Six1基因，从而达到抑制肿瘤的目的。明确Six1在肿瘤的发生、发展进程中的作用，对于恶性肿瘤的早诊断、早治疗以及对预后的评估具有重要意义。

2 Six1基因与肿瘤的关系

2.1 Six1与乳腺癌 异常表达的Six1基因能够促进肿瘤细胞的增殖、存活、迁移及入侵诱发并增强致癌性。有动物实验表明，Six1参与乳腺组织的发育以及乳腺癌的发生、发展过程。Six1基因是转录调控因子，可以通过激活CyclinA1、CyclinD1等靶基因，进行转录，降低其与DNA结合能力，最后经蛋白降解[4-5]，但Six1过表达削弱了此作用，加快整个细胞周期的进程，促使细胞增殖，从而导致肿瘤发生。Coletta等[6]研究报道在乳腺癌细胞中，Six1高表达可上调CyclinA1 mRNA的水平及活性，加速细胞的进程，调节CyclinA1促进肿瘤细胞增生，再通过调控AyclinA2及c-myc等进一步促进乳腺癌干细胞的增生。Wang等[7]研究发现把乳腺癌细胞注入有免疫缺陷的小鼠体内，发现Six1表达能够促进瘤内及瘤周的淋巴管生成、淋巴浸润，并促进肿瘤的远处转移，因此证实Six1和VEGF-C在乳腺癌中是一起表达的。Micalizzi等[8-9]研究表明在乳腺癌细胞中Six1过表达依靠TGF-β信号通路以诱导EMT和远处转移，在这过程中，Six1与Smad3一同增强TGF-β信号。过表达的Six1乳腺癌患者其复发和转移时间较短，总体生存率降低。TGF-β是Six1的新靶点，并暗示Six1是乳腺癌中TGF-β功能的决定性因素。有研究[10]发现，由Six1诱导的EMT被描述为一种常见的癌症进展模式，它可以促进乳腺癌的迁移和侵袭，并发现miR-204-5p可以抑制乳腺癌细胞系的迁移和侵袭。因Six1过表达促进EMT，miR-204-5p通过下调Six1来抑制EMT的机制，还发现上调Six1可以下调miR-204-5p的表达，影响乳腺癌细胞系的迁移和侵袭。总之，乳腺癌中Six1的频繁上调和/或miR-204-5p的下调可能会改变这些相互调节的平衡，并将乳腺癌细胞锁定在间质状态。

2.2 Six1与肝癌(HCC) 据国际癌症研究署发布的全球肿瘤疾病中，2012年全世界有78200例新发肝癌患者，约有746000例患者因肝癌死亡，在中国新发肝癌比例占50.5%，因肝癌死亡的患者占51.3%[11]。有研究[12]探索Six1与DACH1对肝细胞癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，结果表明Six1在癌组织中过表达，而DACH1被抑制。在G2/M期抑制Six1的表达及DACH1过表达，不仅可以抑制细胞增殖，还可以诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期。DACH1过表达时可以通过上调p53的表达抑制肿瘤的发生，而Six1过表达时则通过下调p53的表达加速肿瘤的生长。因此，Six1的降低促进DACH1的表达，从而激活p53的表达并抑制HCC在体内外的表达。Chen等[13]通过对比正常肝细胞，研究Six1在肝癌细胞干细胞特性及化疗敏感性，经功能实验证明，敲除肝癌细胞Six1基因后，增强了其对5-氟尿嘧啶的敏感性，降低了肝癌细胞的干细胞特性，此外，还证明了Six1可以直接结合SOX2(干细胞特性主调节器)启动子，增强其转录和表达。

2.3 Six1与胃癌(GC) Emadi等[14]研究表明从30对胃癌组织标本行实时定量聚合酶链式反应检测Six1基因表达，采用配对t检验或单因素方差分析，结果提示Six1的表达在弥漫性胃癌中显著增加，并且随着病理分级的升高，Six1基因的表达显著增加，在Ⅰ级和Ⅲ级之间的差异更加显著。Xie等[15]通过研究发现Six1在胃癌组织中高表达，不仅可以促进胃癌细胞增殖和侵袭，同时因其过表达增加了cyclinD1、MMP2、p-ERK和EMT相关蛋白的表达，可以通过敲除Six1蛋白而抑制这些蛋白的表达。总之，Six1表达在GC组织中上调，其可以通过MMP2和E-钙粘蛋白及cyclinD1，经由ERK信号侵袭和EMT途径促进GC细胞增殖。这些结果提示了Six1在胃癌细胞增殖和侵袭中的潜在调控机制。

2.4 Sxi1与结直肠癌(CRC) Xu等[16]研究采用原位模型和脾注射转移模型，利用过表达Six1的小鼠结肠腺癌MC38细胞，发现过表达Six1可以显著促进体内CRC肿瘤的生长和转移。在MC38细胞中，过表达Six1提高了乙醛脱氢酶-1的蛋白水平，增加了CD44+/CD166+的数量，表明Six1增加了癌症干细胞的特征。此外，Six1过表达通过上调VEGF的表达来刺激血管生成。Six1过表达的肿瘤细胞通过增加巨噬细胞特异性集落刺激因子、2/5趋化因子(C-C motif)配体和VEGF的表达召集了肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)，进一步促进了CRC肿瘤生长和转移，并且还发现Six1在CRC细胞中激活了丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号。总之，Six1过表达促进CRC的生长和转移，并通过刺激血管生成和召集TAM来重塑肿瘤间质。近来有研究证据表明，微小RNA通过下调Six1在肿瘤的发生和发展中发挥作用，Wan等[17]通过采用实时荧光定量PCR技术检测CRC细胞miR-362和SIX1的表达情况，结果发现与正常组织和细胞相比，CRC组织和细胞系中的miR-362明显降低。53例CRC患者的总生存期与miR-362的低表达之间存在显著的联系。miR-362的下调通过与CRC中SIX1 mRNA的3’-UTR结合来抑制细胞的增殖和侵袭，Six1是miR-362的直接靶基因，miR-362的表达与CRC中Six1的表达呈负相关。Six1可逆转在CRC细胞的增殖和侵袭的部分功能。综上所述，对于Six1对于CRC具体作用机制仍然不清楚，仍然需要进一步探讨。

2.5 Six1与肾母细胞瘤(WT) 复发性肾母细胞瘤(WTs)患儿中约有一半对挽救性治疗产生了耐药性。因此，揭示驱动肿瘤进展/复发的事件非常重要。Spreafico等[18]考虑到收集WTs标本的难度，已经进行一些分析配对的原发/复发性疾病的分子结构的工作，通过研究了8对原发性/复发性WTs全基因组SNP阵列的基因组谱，并研究已知的与WT相关的基因，其中包括Six1、Six2和微RNA处理器基因，近来提出的观点表示这些基因的突变提示更加不良的结果。实验发现在可能复发WT中产生了新生的突变，有的已经在原发肿瘤中认定为有较高的复发风险，其中包括1q和3号染色体的等位基因失衡，以及染色体16q的CN缺失。此外，在原发性肿瘤中，SIX1和DROSHA突变可以是异质性事件(在空间和时间上)，在复发性疾病的进展中它们的共同出现可能是积极的选择。总之，这些结果为WT进展/复发背后的基因组和遗传事件提供了新的见解。

2.6 Six1与子宫颈癌(CC) 宫颈癌是女性第二常见的癌症，占全世界人类新发癌症的5%，其中80%在发展中国家。越来越多的证据表明，micro-RNA在宫颈癌的发生、发展过程中起着重要的作用。Shi等[19]研究microRNA-362(miR-362)在CC中的表达、作用及分子机制，结果发现miR-362的表达水平在宫颈癌组织和细胞系中显著降低。miR-362低表达与宫颈癌FIGO分期、淋巴结转移及血管侵犯相关。通过功能检测显示，miR-362的恢复抑制了CC细胞的增殖、迁移和侵袭，还通过生物信息学分析、荧光素酶报告基因分析、qRT-PCR和western blot分析证实，Six1是miR-362在宫颈癌中的直接靶点。在宫颈癌中，Six1表达上调与miR-362表达呈负相关。此外，Six1敲除可以模拟miR-362过表达对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用。此外，拯救实验表明，恢复Six1足以消除miR-362过表达在宫颈癌细胞中引起的增殖、迁移和侵袭。新发现的miR-362/Six1通路为研究宫颈癌进展提供了思路，并可能代表一种新的治疗靶点。有研究[20]通过收集56对CC组织和癌旁组织标本，同时培养人正常宫颈上皮细胞和CC细胞系。用MTT和迁移实验法检测细胞的增殖和迁移能力。双荧光素酶实验检测Six1与miR-23b间的相关性。结果显示:MiR-23b在CC中明显下调，MiR-23b低表达与CC患者预后差、OS差有关。功能检测显示，miR-23b过表达通过调控AKT/mTOR通路和EMT过程，明显抑制了CC细胞的增殖、侵袭和迁移能力。此外，双荧光素酶实验表明，Six1是miR-23b在CC细胞中的一个功能靶点，说明miR-23b在CC细胞中的抑制功能部分被Six1调控。miR-23b在体内可显著抑制肿瘤生长。总的来说，MiR-23b可以直接靶向Six1，影响AKT/mTOR信号通路和EMT进程，从而抑制CC的进展。

2.7 Six1与非小细胞肺癌(NSCLC) 化疗耐药是非小细胞肺癌(NSCLC)化疗失败的主要障碍，为此寻找耐药的原因就非常重要。据报道[21]，miR-186-5p与非小细胞肺癌细胞(NSCLC)的肿瘤发生和紫杉醇耐药有关。然而，miR-186-5p是否参与了NSCLC对顺铂(DDP)的耐药仍未公开。RT-qPCR和Western blot检测miR-186-5p和Six1的表达。体外用MTT法测定DDP的50%抑制浓度(IC50)和细胞增殖。采用流式细胞术和细胞迁移实验法检测细胞凋亡率和细胞迁移、侵袭能力。在软件上预测miR-186-5p与Six1之间的靶结合，并通过双荧光素酶报告基因分析和RNA免疫沉淀证实。在体内实验中，进行异种移植以监测肿瘤的生长。耐DDP NSCLC组织和细胞(A549/DDP和H1299/DDP)中miR-186-5p表达下调。在功能上，miR-186-5p过表达可抑制A549/DDP和H1299/DDP细胞的增殖、迁移和侵袭，提高细胞凋亡率。在机械上，Six1为miR-186-5p的下游靶点，并在A549/DDP和H1299/DDP细胞中高度表达。同样，Six1基因的下调也可以抑制DDP耐药NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡率，而这是被miR-186-5p下调所逆转的。此外，A549/DDP细胞诱导的移植瘤具有顺铂耐药，而过表达miR-186-5p在DDP处理下可抑制肿瘤生长。总之，miR-186-5p的上调可能通过靶向Six1在体内和体外抑制了DDP耐药NSCLC细胞对顺铂的耐药性。

2.8 Six1与甲状腺乳头状癌(PTC) Six1作为视网膜决定基因网络(RDGN)的关键成员，被认为是各种癌症的肿瘤启动子。然而，其在甲状腺乳头状癌(PTC)中的作用从未被研究过。Kong等[22]研究采用甲状腺癌组织微阵列染色法鉴定Six1及其共激活因子EYA1的表达模式。结果发现与正常组织相比，Six1和EYA1的高表达与恶性肿瘤相关。在甲状腺癌组织芯片中，Six1与EYA1密切相关。功能测定表明，Six1通过在转录后水平稳定EYA1而增加了EYA1表达。此外，Six1通过激活STAT3信号及其下游靶点以EYA1依赖的方式促进甲状腺癌的增殖和侵袭。Six1可以通过激活经典的STAT3信号，与EYA1整合，促进PTC的发展。

2.9 Six1与前列腺癌(PCa) 越来越多的证据表明，Six1的过表达在肿瘤发生中起着关键作用。然而，Six1的表达状态及其与前列腺癌临床病理特征的关系尚不清楚。此研究检测了前列腺癌组织和正常前列腺组织中Six1的mRNA及蛋白水平。应用免疫组织化学方法(IHC)对前列腺癌组织芯片进行临床病理意义的研究。应用卡方检验分析Six1蛋白表达与前列腺癌临床病理特征的相关性。与正常前列腺组织相比，大多数前列腺癌患者的Six1蛋白表达增加。Six1高表达患者与高组织学分级(χ2=58.651,P=0.00)，高临床分期(χ2=57.330,P=0.000)，高格里森评分(χ2=63.480,P=0.000)，高原发肿瘤分级(χ2=57.330,P=0.000)和阳性区域淋巴结转移(χ2=19.294,P=0.000)。此外，单变量和多变量生存分析表明，Six1是对总生存期一个独立的预后指标(P<0.05)。Six1用于识别有肿瘤进展风险的前列腺癌患者，可能用于预测前列腺癌患者的生存结果[23]。许多研究表明，miR-30a的下调存在于包括前列腺癌(PCa)在内的多种癌症中。Zhu等[24]研究miR-30a在PCa细胞系中的生物学功能和分子机制，发现miR-30a在PCa组织和细胞系中被下调。此外，低水平的miR-30a与前列腺癌组织和细胞系中Six1的表达增加有关。miR-30a的上调显著抑制PCa细胞的增殖。过表达miR-30a可以抑制PCa细胞的侵袭。然而，miR-30a的下调促进了细胞的生长和PCa细胞的侵袭。生物信息学分析预测，Six1可能是miR-30a的靶基因。接下来，荧光素酶报告基因实验证实miR-30a可以直接靶向Six1。与miR-30a的作用一致，siRNA下调Six1可以抑制PCa细胞的增殖和侵袭。在PCa细胞中过表达的Six1部分逆转了miR-30a模拟物的作用。综上所述，miR-30a的引入通过下调Six1的表达显著抑制了PCa细胞的增殖和侵袭，而下调Six1对于过表达miR-30a抑制细胞生长和侵袭PCa细胞至关重要。

3 结语

目前研究发现，Six1在多种恶性肿瘤的发生、发展中产生作用，与肿瘤的转移及预后相关。异常表达的Six1基因可以通过多种信号通路导致正常细胞的凋亡与增殖失衡，上游调控因子的异常表达导致Six1的功能失调，而Six1异常表达作用于其靶基因CyclinA1、TGF-β等，从而促进肿瘤的发生发展。近来对Six1基因的上游调控机制以及Six1下游的靶基因有了很大突破，解释了Six1基因在信号通路间的分子机制，为了解恶性肿瘤具体的发病机制，寻找新的肿瘤标志物提供新的思路。