S100A8/A9和S100A12与动脉粥样硬化关系的研究进展

陈杏兰，李胜男，陈少凤，邓福，朱佩仪综述 李友审校

1.广东医科大学附属医院神经病学研究所，广东 湛江 524001；

2.广东省衰老相关心脑疾病重点实验室，广东 湛江 524001

动脉粥样硬化导致的心、脑血管疾病是严重危害人类生命和健康的疾病之一，而动脉粥样硬化发病机制十分复杂。因此，在探索动脉粥样硬化形成的病理生理及分子机制过程中，寻找动脉粥样硬化早期诊断、判断预后及指导新治疗方法的新标记物已成为当前的研究热点。当前，越来越多的研究表明：S100 家族中的S100A8/A9 和S100A12 不仅有望成为判断动脉粥样硬化严重程度及预后的新标志物，而且有望为心肌梗死及缺血性脑梗死患者提供新的治疗思路。

1 S100家族与S100A8/A9和S100A12

1.1 S100家族概述 由于S100蛋白可以溶解在100%中性饱和硫酸铵中，被MOORE等于1965年首次在牛脑组织中发现了,分子量较小 (9 000～13 000) 的钙结合蛋白家族。S100 家族的成员分别由各自的基因编码，现今至少有24 个成员，其中包括S100A1-16、S100G、S100P、S100B等，S100蛋白家族成员的结构和功能各不相同，但都包含一个EF手结构，该结构在氨基末端和两个梭基末端都能结合钙离子。该结构为螺旋一环一螺旋结构，两侧则为疏水区，中间为铰链区。N末端通常具有环状结构，与钙离子具有低的亲和力，但C末端与钙离子具有高的亲和力。两种EF手结构中间的铰链区和梭基延伸区的每个家庭成员之间差异很大，因为每个成员的生物活性具有自己独特的特征。S100蛋白通过与多种配体结合而发挥不同作用，主要包括晚期糖基化终产物 (receptor for advanced glycation end products，RAGE) 受体、Toll 样受体 (Toll-like receptor，TLR) 、高级糖基化终产物 (AGEs) 、膜联蛋白A2、p53等。S100蛋白家族具有多种生理功能，如参与炎症反应、调节氧化应激、调控细胞凋亡、糖原磷酸化、聚集巨噬细胞等。

1.2 S100A8/A9和S100A12结构及功能特性

1.2.1 S100A8 和S100A9 S100A8 和S100A9 是S100 家族的重要成员，主要由免疫细胞 (如嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞) 分泌，这些细胞富含S100A8和S100A9，约占45%的粒细胞胞浆蛋白，它们参与炎症反应，并成为急性和慢性炎症的重要炎症前介质。其分子量分别为10.8 kD 和13.2 kD，分别由93个和113 个氨基酸残基组成。S100A8 和A9 基因与S100 蛋白家族的其他基因一起位于染色体1q21 的位置，形成了S100基因簇 (gene cluster) ，该基因簇是染色体变化的热点区域，有报道指出该区域染色体的变化或减少与癌变的发生有密不可分的关系[1-2]。S100A8、S100A9在体外和体内均能形成稳定的异二聚体或同二聚体。但是它们更容易形成异二聚体，并且S100A9的表达在维持S100A8蛋白的稳定性中起着重要作用[3]。S100A8/S100A9的每个单体包括4个α螺旋 (HⅠ、HⅡ、HⅢ和HⅣ) 和2个环 (环Ⅰ和环Ⅱ) ，N端和C端序列是相对疏水的残基，S100A9 的C 端是所有S100 蛋白家族中最长的；S100A8/A9 蛋白二聚体，又名钙卫蛋白，也被称为骨髓相关蛋白 (myeloid-related protein，MRP) ，是由两个单体形成的螺旋，特别是HⅠ和HⅣ，它们形成了紧密的四个螺旋束[4]。S100A8/A9 的作用多种多样，既可以调节炎性细胞的迁移和附着，又具有抗微生物炎症反应，减少细胞增殖，调节免疫，诱导凋亡，促肿瘤细胞生长和其他生物学功能。最近的研究表明，S100A8 和S100A9 水平的升高与心血管疾病和动脉粥样硬化的增加有关[5]。

1.2.2 S100A12 S100A12 (又称细胞外新认定的RAGE 结合蛋白即EN-RAGE、钙粒蛋白C) 也是S100 家族重要成员之一，和S100A8、A9 一样，为具有手型EF结构的钙结合蛋白，主要由参与炎症反应的免疫细胞如中性粒细胞合成和分泌表达，最早是在牛肺组织液中被发现。S100A12由92个氨基酸组成，其相对分子量大小为10.575 kD[6]。该结构由反向平行、鞍形的四个螺旋亚基组成，以二聚体存在居多。它与钙离子有很高的亲和力，并在与一定浓度的钙离子结合时形成六聚体。在炎症介质刺激后，蛋白可发生构象变化，暴露靶蛋白的结合位点，使之与特异性的蛋白或肽类物质结合，从而发挥生物学功能，如参与激活炎性细胞、导致炎细胞迁移、黏附、趋化作用和抗微生物作用、代谢性及肿瘤性疾病的病理生理过程和主动氧化防御。S100A12与血管内皮黏附因子的表达有密切联系，能激活炎症细胞引起趋化作用[7-8]，进一步加剧动脉粥样硬化过程中血管壁的慢性炎症。此外，S100A12 是RAGE 和TLR-4 的内源性配体，以及AGEs的内源性受体配体。其中最著名的是RAGE，一种传递炎症刺激的多配体受体，其与S100A12的结合可激活涉及NF-κB 和介导炎症和动脉粥样硬化的炎性细胞因子的炎性级联反应。最近的研究发现，S100A12水平升高与动脉粥样硬化性心血管疾病[9]和颈动脉粥样硬化[10]之间存在显著相关性。

2 S100A8/A9和S100A12与动脉粥样硬化的关系

2.1 动脉粥样硬化及斑块形成机制 动脉粥样硬化是由活化的巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和平滑肌细胞介导的血管壁慢性炎症过程[11-13]，可导致动脉粥样硬化斑块缓慢形成。这与炎症、高胆固醇血症、血脂异常、高血糖和血管紧张素系统失调等相关[14-15]。动脉粥样硬化的特征在于动脉内膜中过多的脂质沉积，脂质沉积在内膜中发生聚集和氧化导致修饰后的脂质结构 (最小氧化脂质，oxLDL) 的产生，引起先天免疫和适应性免疫应答的缓慢刺激，进而导致血管壁慢性炎症形成。内皮细胞和血管平滑肌细胞的诱导可导致黏附分子、趋化剂和生长因子的表达增加[16]。这些因子与单核细胞上的受体相互作用，导致单核细胞回归、迁移和转化为树突状细胞和巨噬细胞。单核细胞黏附在内皮细胞上，逐渐增多后移入内膜下成为巨噬细胞，通过清道夫受体吞噬oxLDL，转变为泡沫细胞，形成最早的粥样硬化病变脂质条纹，并通过动脉粥样硬化、粥样斑块和纤维粥样斑块进展变化，从而形成稳定的斑块。炎症、病毒和细菌的感染、内皮和血管平滑肌细胞的失调都可以导致斑块的形成。稳定斑块是由厚的纤维帽和脂质丰富的粥样斑块组成的。而不稳定斑块 (又称易损斑块) 的特征是存在薄的发炎的纤维帽，伴随着脂质核、坏死核心，新血管形成增加，出现炎症，血管中膜和外膜改变，斑块内出血和积极的血管重塑[17]。纤维帽变薄是通过基质金属蛋白酶 (mmps) 降解细胞外基质的胶原含量而介导的[18-20]，其变化进展和易脆性受到病毒、细菌及其产物的感染和炎症的影响。不稳定斑块被描述为易破裂的斑块，易发生血栓形成和缺血事件，如急性冠脉综合征、缺血性脑卒中等。

2.2 S100A8/A9 和S100A12 在动脉粥样硬化病变中的作用 炎症是公认的动脉粥样硬化形成的危险因素。而S100蛋白家族在炎症的调节中发挥作用，在多种炎症条件下其表达显著增加。其中，S100A8、S100A9和S100A12是炎症的标志物，可在炎症过程中高表达，在多种炎症性疾病的发病机制中具有重要作用。已有多项研究提示S100A8、S100A9 和S100A12参与动脉粥样化形成。AZHAR 等[10]的研究显示颈动脉粥样硬化患者的血浆S100A12 水平显著高于对照组，血浆S100A8/S100A9 水平呈中度升高；有最新症状的患者颈动脉粥样硬化斑块中S100A8、S100A9 及S100A12 的mRNA 水平较其余患者有所增加。OZLEM 等[21]的研究提示血浆S100A12 水平升高与动脉粥样硬化密切相关；并且随着年龄的增长，血浆S100A12 水平升高，可能在腹膜透析患者中显示出强大的致动脉粥样硬化潜能。ZAFER等[22]在正常冠脉、稳定的冠脉病变及急性冠脉综合征 (ACS) 患者中的临床研究显示，与正常冠状动脉和稳定冠状动脉疾病患者相比，ACS 患者S100A12 水平显著升高 (P=0.001) ，并有统计学意义。MASASHI SAKUMA等[23]在连续38例急性冠脉综合征患者中发现有23例确诊为抽吸性血栓的患者其冠状动脉血MRP-8/14 (S100A8/A9) 水平高于未发现血栓的15例，而且MRP-8/14 (S100A8/A9) 水平与冠状动脉内髓过氧化物酶 (MPO) 水平相关；血栓的免疫组化结果显示MRP 8/14 (S100A8/A9) 的表达与活化的Mac-1 阳性白细胞共定位；此外，在培养的人脐静脉内皮细胞中，MRP-8/14 增加了组织因子的表达。通过以上实验结论可得知，三者血浆水平均在动脉粥样硬化病变中不同程度地升高、斑块中mRNA表达也有所增加，说明它们通过招募炎症细胞、增加组织因子的表达引起炎症反应的增强等途径参与到动脉粥样硬化的进程及斑块形成中。而且S100A12 在动脉粥样斑块不稳定甚至破裂介导的缺血性事件中起重要作用，如ACS中S100A12水平明显升高。由此可见，S100A8、S100A9及S100A12血清浓度水平的升高与动脉粥样硬化、斑块不稳定介导的急性冠脉综合征等心血管疾病明显相关，其受体RAGE、TLR-4在许多炎症反应中起关键作用，并且在动脉粥样硬化等心血管疾病中具有重大意义。此外，AGEs (高级糖基化终产物) 也参与S100A8、S100A9、S100A12介导的炎症引起的动脉粥样硬化。

2.3 S100A8/A9 和S100A12 参与动脉粥样硬化的相关机制

2.3.1 晚期糖基化终产物 (RAGE) 临床已在动物和人类中研究了RAGE，它是炎症和动脉粥样硬化的重要介质，在炎症反应中可传递释放或上调的信号。RAGE 是1992 年从牛肺中鉴定出来的一种结合晚期糖基化终产物的蛋白质，在包括内皮细胞、单核细胞和血管平滑肌细胞在内的多种细胞中表达。主要由三个免疫球蛋白结构域 (V，C1 和C2) 组成、跨膜生成螺旋和用于信号传导的胞质结构域[4，24]。RAGE可与多种配体和信号分子结合，如S100 家族蛋白成员、晚期糖基化终产物 (AGE) 、β淀粉样蛋白 (β淀粉样蛋白) 、高迁移率群盒1 (HMGB-1) 、补体系统成员等。有研究显示缺乏RAGE 的apoE-/-小鼠的动脉粥样硬化减弱[25]，这说明RAGE 可激活多种信号通路从而参与动脉粥样硬化进程。S100A8、A9、A12 与内皮细胞上的RAGE 结合调控的炎症信号转导通过参与血管内皮及血管壁损伤引起内皮功能障碍介导动脉粥样硬化。在S100A9基因敲除的小鼠中，S100A8/A9的缺乏减少了血管受损后颈、椎动脉闭塞的时间[26]，提示血管内皮细胞正常分泌表达RAGE时，S100A8、A9的缺乏仍能减低血管壁损伤后内皮功能障碍引起的动脉粥样硬化及附着斑块和血栓形成，两者的结合在该过程中扮演着重要角色。研究显示，S100A9 基因敲除小鼠的大动脉血管粥样硬化厚度比对照组降低约30%[27]，这种减少并不因血中脂肪含量的高低差异所致，而是病变部位巨噬细胞的招募集合减少所致；而且，这种基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块中单核细胞及中性粒细胞的聚集也减少。在RAGE 分泌表达不变的情况下，S100A9基因敲除后动脉粥样硬化病变明显减少。说明在炎症介导的动脉粥样硬化中S100A8、A9与RAGE结合能促进免疫细胞的聚集，使斑块中炎症细胞浸润，加强血管炎症反应，促进动脉粥样硬化形成。HOFMANN 等[28]建立了表达S100A12 的ApoE-/-小鼠模型；将野生型小鼠和ApoE-/-小鼠进行比较，表达S100A12的ApoE-/-小鼠的主动脉粥样硬化斑块的面积更大，血管钙化斑块增多更为明显。这说明血管平滑肌分泌的S100A12 能加速粥样硬化的进展并增强由动脉粥样硬化触发的骨生成，促进血管钙化。因此，S100A12 在动脉粥样硬化病变中起重要作用，考虑为和RAGE 结合后激活炎症细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞等胞内信号转导通路，主要为激活核因子kappa-B、释放细胞因子，表达黏附分子、产生活性氧等途径[29-32]，导致白细胞浸润、氧化应激加剧以及血管炎症反应，因增强了炎症反应及组织损伤，进一步引起粥样斑块形成导致动脉粥样硬化甚至斑块破裂。S100A8、S100A9、S100A12 对配体RAGE 的结合也可以触发多个下游信号级联，包括有丝分裂原蛋白活化激酶 (MAPK) 、磷酸肌醇3-激酶 (PI3K) 、Ras 同源-GTPase (Rho-GTPase) 、Janus激酶/信号转换器和转录激活因子 (JAK/STAT) ，细胞分裂调控蛋白42同源物/Ras 相关的C3 型肉毒杆菌毒素底物1 (CDC42/RAC1) 和核因子[NF- (B) ]和活化素蛋白1 (AP-1) 的激活[33-36]，导致产生特异性炎症因子，在炎症中起关键作用。许多研究显示在RAGE存在时，S100蛋白转基因小鼠中白细胞炎症调节相关的基因转录增强了，但这种转录在完全缺乏RAGE 的小鼠中消失了[37]，这再次表明了RAGE 与S100 蛋白的结合在炎症过程中起关键作用。同时，在ApoE-/-小鼠中发现，S100A9或RAGE的基因消除可减少动脉粥样硬化[38]，说明两者的结合在动脉粥样硬化过程中起关键作用，可促进炎症反应，加剧动脉粥样硬化产生。因此，RAGE 与S100A8、S100A9和S100A12结合，在炎症诱导的动脉粥样硬化中发挥潜在作用。

2.3.2 Toll 样 受 体4 (TLR-4) TLR-4 是 一 种 跨膜信号转导受体，通过p38 丝裂原激活的蛋白激酶 (MAPK) 发挥作用，其在诱导机体产生炎性反应中起重要作用[39]。S100A8/A9、S100A12 都是Toll 样受体4 (TLR-4) 的内源性配体，并且先前的研究表明S100A8/A9 与TLR-4 结合的信号传导参与了各种炎症反应。SCHENTEN等[40]的结果表明，只有磷酸化形式的复合物诱导促炎细胞因子的表达和分泌，并首次证明S100A8/S100A9 能通过Toll 样受体4 信号通路诱导细胞因子的分泌。CHEN 等[41]的研究提示，急性冠脉综合征 (ACS) 和冠心病 (CHD) 患者血清cox-2、tlr-4 和S100A8/A9 水平明显高于健康对照组 (P＜0.05) ；在大鼠颈动脉血栓形成模型中，ACS组S100A8/A9表达与TLR-4、COX-2明显相关，在CHD组则与TLR-4显著相关。说明s100a8/a9在血管损伤后上调，并通过丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) p38激活与Toll样受体4和环氧化酶-2 联合诱导增强。S100A8/S100A9 与TLR 4结合，在细胞内触发一种特殊的信号通路，从而形成自分泌的正反馈环，并放大内毒素引起的炎症因子如细胞因子、趋化因子和肿瘤坏死因子 (α) 的上调，进一步增强炎症反应。AZHAR等[10]的研究表明，在THP-1单核细胞中，Toll样受体4和2的激活增加了S100A8、S100A9、S10012 和白细胞介素-1、干扰素和凝血酶激活血小板释放物的mRNA 水平，并显著增强了S100A12的表达。由此说明，TLR-4不仅通过与S100蛋白的结合参与动脉粥样硬化，还可上调三者的表达，进一步增强其在动脉粥样硬化中的作用。oxLDL可诱导TLR 4 的表达增加，从而促进促炎症细胞因子的产生。TLR 4还参与动脉粥样硬化过程中的脂质沉积。TLR4 的信号传导可被TREM-1 放大并进一步增强炎症和免疫反应[42]。TLR-4 参与冠状动脉粥样硬化、缺血性脑卒中动脉粥样硬化、病理性心肌重塑和组织损伤等的发展。

2.3.3 高级糖基化终产物 (AGEs) 还原糖与蛋白质，脂质或核酸上的游离氨基之间的非酶促反应所形成复杂结构的异质基团，称为AGEs。AGEs 与RAGE 的结合可改变细胞内信号转导，导致单核细胞活化和巨噬细胞迁移增加[43]，介导炎症反应，诱导动脉粥样硬化形成。此外，AGEs 还可以诱导血管平滑肌细胞功能障碍、调节胆固醇的摄取以增加巨噬细胞中的脂质蓄积，从而使泡沫细胞增多、加剧动脉粥样硬化和斑块形成。AGEs 浓度升高，氧化应激和炎症反应增加能进一步促脂质沉积，引致动脉粥样硬化的发展进程。而S100A8、S100A9 表达增加即可引起AGEs 的积累[44]，使AGEs 上述活动增强，进一步影响动脉粥样硬化形成。故此，S100A8、A9 可通过增加AGEs的积累而影响动脉粥样硬化的形成。

2.3.4 晚期糖基化终产物 (sRAGE) C 截断RAGE是一种可溶性片段，被称为sRAGE的人可溶性受体。由于其能与RAGE 竞争与AGEs 结合的能力、限制其他配体和RAGE的结合[45]以及缺乏胞内信号转导，又称为拮抗诱饵式受体。sRAGE 能阻止AGEs 的激活、减少配体进入RAGE，从而减少炎症损伤、延缓炎症介导的动脉粥样硬化，故此认为sRAGE可能在动脉粥样硬化过程中担任保护角色。血管钙化是动脉粥样硬化的重要特征之一，亦是动脉粥样硬化的必然终点事件。WANG 等[46]研究的Logistic 回归分析显示血清S100A12 水平是严重冠状动脉钙化发生的独立影响因素，血清S100A12水平的升高与冠状动脉钙化的进展呈正相关。在表达S100A12 小鼠上建立的慢性肾病小鼠模型中显示：在高脂以及慢性肾病导致的炎性环境中，S100A12 可与RAGE 结合，这一过程可进一步加速血管钙化[47]。KIM等[48]的一项研究也证明了血浆s100A12与血管钙化呈正向关系，而sRAGE与其钙化程度呈反向关系。JI等[49]的研究也表明血液透析患者的循环sRAGE 水平越低，则血管钙化程度越高。综上，考虑sRAGE 并不参与加速血管钙化的进程，对动脉粥样硬化起保护作用。因此，sRAGE可能是减少动脉粥样硬化、保护身体的一个因素。当释放到血液中时，sRAGE会抑制RAGE与其配体的结合，或可以捕获RAGE配体、从而减少循环可测量的RAGE，降低RAGE轴的活动，从而减少炎症反应，减慢动脉粥样硬化。早前的研究也显示了sRAGE浓度可能与冠状动脉粥样硬化的严重程度和炎症过程有关，sRAGE 联合S100A12可作为严重冠心病的预测指标。

3 展望

目前的研究认为，S100A8/A9 和S100A12 蛋白是能促炎的钙结合蛋白，它们在血浆和其他身体部位中的炎症过程中表达增加并累积，通过不同机制激活参与炎症的细胞，在炎症反应不同过程中起调节作用，参与动脉粥样硬化的慢性炎症病理过程。这使S100A8/A9和S100A12在动脉粥样硬化性疾病和其他各种炎症性疾病中成为有价值的生物标志物和示踪剂。为了进一步将S100A8/A9和S100A12用作炎症性疾病的生物标记物，并阐明S100A8/A9 和S100A12 阻断剂在炎症性疾病的治疗中的潜在应用，未来的研究 (包括临床试验) 将是必要的。S100A8/A9 和S100A12有望为动脉粥样硬化性疾病以及其他炎症性疾病的预防、诊治提供重要的分子依据和治疗靶标。