N-糖基化对蛋白质药物关键质量属性影响机制的研究进展

刘国芳，刘晓志，高健，王志明

综述

N-糖基化对蛋白质药物关键质量属性影响机制的研究进展

刘国芳，刘晓志，高健，王志明

050015 石家庄，华北制药集团新药研究开发有限责任公司抗体药物研制国家重点实验室

蛋白质糖基化是真核生物蛋白质翻译后修饰的主要方式。它分布于许多膜结合蛋白上，以 N- 或 O- 形式和蛋白质连接，其中 N- 连接是天冬酰胺（N）和聚糖连接，O- 连接主要是苏氨酸（T）或丝氨酸（S）同聚糖连接。许多激素、酶以及抗体的N-糖基化位点一般含有保守序列 N-X-S/T（其中 X 为非脯氨酸的氨基酸），糖基化蛋白一般分布于细胞外，内质网（endoplasmic reticulum，ER）、高尔基体和溶酶体内[1]。

N-糖基化反应在内质网（ER）内开始，ER 和高尔基体内的多种糖苷酶和糖基转移酶参与这个修饰过程。治疗性抗体药物的 Fc 区域有一个 N-连接聚糖，位于重链 CH2 结构域中的 N297。它具有复杂的双触角型结构，核心结构为甘露糖 α1,3 和甘露糖 α1,6 键连接的 2 个糖链，添加半乳糖和唾液酸延长糖链。

当含有 N-糖基化共有序列的新生抗体通过 ER 膜时，N-聚糖前体[包含有 3 个葡萄糖（Glc），9 个甘露糖（Man）和 2 个 N]通过寡糖基转移酶将乙酰葡糖胺（GlcNAc）转移至新生多肽的 N 侧链的酰胺氮上。在ER 内，N-聚糖末端的葡萄糖残基被 α-葡糖苷酶依次修剪，蛋白质正确折叠后形成寡甘露糖 9（Man9 或 Man9-GlcNAc2）结构。随后通过 ER α-甘露糖苷酶 I 除去 Man9 中的 α1,2-连接的甘露糖，并且将聚糖转化为寡甘露糖 5（Man5 或 Man5-GlcNAc2）结构。当抗体从 ER 转运到高尔基体时，通过糖苷转移酶 I（GlcNAcT I）将 GlcNAc 添加到 Man5 的 α1,3 臂末端甘露糖上，成为杂合型分子。α1,6-岩藻糖基转移酶 VIII（FucT VIII）催化 α1,6-岩藻糖转移到 GlcNAc-GlcNAc 核心中的最内部的 GlcNAc 上，将聚糖转化为岩藻糖型聚糖。双触角聚糖的 α1,6 臂中的非还原甘露糖被 α-甘露糖苷酶 II 进一步修剪，剪切掉另一个 GlcNAc，即形成双触角复合型聚糖 G0F。从高尔基体到反式高尔基体的转运过程中，抗体的聚糖被半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶进一步加工，形成半乳糖、唾液酸和半乳糖的聚糖。聚糖的生物合成不是 DNA 直接参与，因此抗体药物上的 N-聚糖通常情况下是异质性的。重组治疗性抗体中的 N-聚糖结构，包括寡聚甘露糖（Man5 和 Man6）例如，杂交（G0F-Gn 和 G0-Gn）或复合型聚糖（G0F 和 G1F）。其中，G0F 和 G1F 是抗体药物中主要的聚糖类型。然而，当抗体发酵生产时，使用 α-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶 I 或 α-甘露糖苷酶 II 抑制剂，N-聚糖的过程被阻断，聚糖的最终形式以寡聚糖或杂交体形式存在[2]。使用酶抑制剂生产的抗体药物，N297 连接的 N-聚糖型为简单双触角型，不包含半乳糖基化或唾液酸化结构。这些糖蛋白或抗体的糖基化差异与表达系统、细胞系或细胞培养条件有密切相关。

N-聚糖不但会影响蛋白质功能，还影响治疗性抗体药物的稳定性、药物动力学（PK）和免疫原性。本综述将重点介绍N-糖基化对蛋白质药物这些关键质量属性影响机制的研究进展。

1 N-糖基化对蛋白质稳定性的影响

低蛋白质浓度、低 pH 或加热都可能引发蛋白质变性。化学变性包括蛋白质内共价键的形成或破坏，如脱酰胺、氧化、二硫化物交换和肽键水解等。物理变性包括聚集、热变性和溶解度降低等。这些都加速蛋白质的降解或聚集，引发患者不良免疫应答，导致药物的安全性和有效性下降。

聚糖具有高亲水性，在蛋白质稳定性中起重要作用。聚糖可以保护蛋白质药物免受蛋白酶水解、氧化、凝聚、pH 等环境的变化。糖基化蛋白质药物包括重组或提取纯化的细胞因子和酶，如促红细胞生成素（EPO）、干扰素-b（IFN-b）和干扰素-g、核糖核酸酶（RNase）、α-半乳糖苷酶和三肽基肽酶等。此外，重组人 EPO 活性与四触角和双触角聚糖比例有关，非糖基化的 EPO 则缺乏生物学活性，而且热稳定性和 pH 稳定性也差。重组人 IFN-b 含有单个 N-糖基化位点，聚糖结构相对均一，具有完全的唾液酸化和岩藻糖基化结构，这种聚糖结构对于维持蛋白质溶解度非常重要[3]。

对于 N297 聚糖对抗体稳定性影响的研究发现，利用几种外切糖苷酶（包括唾液酸酶、β-半乳糖苷酶、β-己糖胺酶和 α-甘露糖苷酶）对抗体 IgG1-Fc 的 N297 聚糖进行依次去除，利用微量热扫描法研究这些糖基化物热稳定性的变化。随着 N297 聚糖 α-甘露糖残基的逐步去除，Tm显著降低，Tm是 CH2 结构域展开所需的热转变温度。当 N-聚糖被完全去除后，抗体的高聚集性显著增加，尤其酸性条件下更为明显。

利用毕赤酵母生产抗体，研究单糖基化和非糖基化的 IgG1-Fc 蛋白的结构稳定性。研究发现，二糖基化或单糖基化的抗体中主要是 Man8 聚糖，在 pH 4.0 ~ 6.0 时，二糖基化和单糖基化的抗体分别显示出最高和最低的结构稳定性，但非糖基化形式抗体的稳定性居中，其具体原因尚不清楚[4]。

研究者对 CHO 细胞或 HEK293 细胞表达的，含有复合型（G0F 和 G0）寡甘露糖（Man9）聚糖的单克隆抗体生物物理和生化特性进行了研究。结果发现，具有 G0F/G1F、G0F 或 G0 聚糖的抗体中，CH2 结构域的 Tm没有显著差异，杂合或低甘露糖聚糖的抗体具有较低 Tm，去糖基化的抗体 Tm最低。上述研究说明，糖基化在蛋白稳定性中起重要作用，去糖基化的抗体极易被多种蛋白酶（人中性粒细胞弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶）水解，而低甘露糖聚糖或复合型聚糖的抗体具有更高抵制蛋白酶水解的能力[5]。

抗体除了在 Fc 有糖基化外，15% ~ 25%的血清 IgG 的 Fab 也有 N-糖基化位点，这种糖基化，有助于增加抗体的多样化。Fab 聚糖不仅可以影响抗原抗体结合，还影响抗体稳定性。去除抗体的 Fab 的糖基化，将导致抗体热稳定性下降。

研究显示，蛋白质糖基化是通过影响蛋白质构象，进而影响其稳定性的。例如，IFN-b-1a 结构分析显示，N-聚糖与肽骨架形成氢键，隔离疏水性或易聚集氨基酸残基，而当去除 N-聚糖后，蛋白质稳定性下降，蛋白质凝聚倾向性增加。现有研究发现，抗体 N297 聚糖位于 Fc 的内部呈“马蹄形”，具有一定柔性[6]。在双触角 α-1,6 复合型聚糖中，位于 CH2 结构域的氨基酸残基相互作用，这些氨基酸残基包括 T260、E258、F243、K246。然而，α-1,3 复合型聚糖位于两条重链之间，具有更高流动性。

氢/氘交换质谱研究发现，当抗体中复合型聚糖被高度半乳糖基化时，来自附近氨基酸（L242、F243 和 K246）的氢会被更好的保护，而免于发生交换[7]。核磁共振研究表明，α1,6 型 N297 聚糖似乎处于蛋白结合和未结合两种状态。N297 聚糖对 IgG-Fc 构象影响的研究发现，去除 N-乙酰葡糖胺和甘露糖残基，将影响 N-糖基化位点的多肽环构象，CH2 结构域相互作用导致产生“封闭”构象。聚糖位于蛋白质疏水区域，因此 N297 聚糖的去除，将导致更多 CH2 疏水结构域发生相互作用。有学者通过核磁共振研究了非糖基化 Fc（由大肠杆菌表达）的结构，结果显示非糖基化 Fc 没有明显可以区分的四级结构[8]。上述研究说明，gG1-Fc 中 N-聚糖的主要作用，是通过聚糖和肽骨架之间的分子内相互作用，维持抗体基本结构的稳定[8]。

研究者尝试应用重组蛋白糖基改造方法来增加蛋白质稳定性，研究发现，增强芳香序列（F-Y-N-X-T，其中 X 不是脯氨酸，Y 是任何氨基酸）存在的 N-聚糖，可以稳定几种蛋白质的天然结构。这种可以增强蛋白质结构稳定性的原因是，增强芳香序列中存在的 N-聚糖和蛋白质侧链之间的糖相互作用。CH2 结构域 C'E 环中的 N297 糖基化位点通常是 IgG 中最不稳定的结构域，在这个区域引入增强芳香序列可以增强其稳定性。常用的方法是对 N297 周围氨基酸进行突变，包括 Q295F 和 Y296A，产生增强芳香序列[9]。结果表明，改造抗体热稳定性得到改善，CH2 结构域 Tm值增加 4.8 ℃。尽管其对 FcRn 和 FcgRI 的亲和力没有改变，但是与其他 Fcg 受体的结合降低。同时，Fc 的糖型也从 G0F 和 G1F 转变为主要以 G0F 和杂合型为主的糖基结构。增强芳香序列的 IgG1 Fc 片段的晶体结构研究，证实最内层 GlcNAc 和 F295 之间的相互作用，同时也发现 GlcNAc1 的核心岩藻糖也参与同 F295 的相互作用。另一项研究，在贝伐单抗 Fab 结构域的聚集倾向氨基酸残基附近，引入 N-糖基化位点，用聚糖掩蔽这些氨基酸残基，这种设计将导致抗体聚集性降低。据报道，抗 IL-13 抗体的糖工程化显著增加了其溶解度。与其他方法相比，例如通过定点诱变，改变等电点或降低整体表面疏水性等方法，重新引入 N-聚糖将大大提高抗体溶解度，同时保留了与抗原的亲和力。由于糖基化在蛋白质稳定性中发挥作用，因此蛋白质糖基化工程化改造，可以在很大程度上增加白蛋白稳定性。

2 N-糖基化对蛋白质药代动力学的影响

除稳定性外，蛋白质药代动力学（PK）是另一个重要特性，它与治疗性蛋白质的临床效果直接相关。如果肝脏对药物降解增加，将降低血清药物浓度，减少蛋白质达到疾病靶标的有效量。N-聚糖在调节血清药物浓度中起着重要作用，抗体药物的糖基化程度均一性差，这和表达系统或细胞培养条件有关。其中，唾液酸化聚糖对药物等电点特性有显著影响。含有较高唾液酸的治疗性蛋白质，其等电聚焦凝胶的等电点（pI）值低于唾液酸化较少的值。由于缺乏与去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）的结合，前者通常表现出比后者更长的半衰期。糖蛋白清除受多种聚糖结合蛋白调节，包括 ASGPR、甘露糖受体（ManR）以及非人类聚糖结合蛋白。高度唾液酸化的重组蛋白的较长半衰期可能是由于其干扰了唾液酸与 ASGPR 介导的清除。

ASGPR 和 ManR 都是内吞型受体，在肝脏中大量表达。ASGPR 是发现的第一种可以和哺乳动物聚糖结合的蛋白。人 ASGPR 由 2 个 II 型跨膜糖蛋白亚基组成，去唾液酸糖蛋白受体-1（Asgr-1）和 Asgr-2。这 2 个亚基以Asgr-1-Asgr-2 异寡聚体或同源寡聚体形式存在，如异三聚体形式每个亚基含有 C 型碳水化合物识别结构域（CRD）和茎区作为 C 末端细胞外结构域，跨膜区和内吞作用信号的 N-末端细胞质结构域。该蛋白质主要表达在肝细胞窦状表面上，主要与末端半乳糖或 N-乙酰半乳糖胺（如三触角或四触角聚糖）结合，具有较高亲和力。使用基因缺陷小鼠研究 ASGPR 的病理生理功能，报告显示，Asgr-1 对于维持血浆中 Von Wille 因子和凝血因子 VIII（FVIII）的正常水平至关重要，这表明其在调节血液凝固和血栓形成中发挥重要作用[10]。

ManR（CD-206，Mrc1）是一种 175 kD 的 I 型跨膜糖蛋白，含有 N 末端半胱氨酸的 R 型 CRD，纤连蛋白 II 型结构域和 8 个 C 型 CRD 作为细胞外结构域，以及跨膜结构域。在一个 8 个连续的 C 型 CRDs 中，CRDs 4 和 5 参与结合末端甘露糖、GlcNAc 和岩藻糖。ManR 分布在肝脏内皮细胞（例如库普弗细胞、巨噬细胞和未成熟细胞），C 末端位于细胞质中。ManR 敲除小鼠在清除带有末端甘露糖或 GlcNAc 残基的蛋白质方面存在缺陷，并且有 8 种不同溶酶体水解酶的水平升高。最近使用 ManR 和 ASGPR 缺陷小鼠研究也表明这两种受体在控制药物血清水平方面的关键作用，许多糖蛋白都与生殖激素和血液凝固调节密切相关[11]。

此外，肝脏中 ASGPR和 ManR 也参与多种重组治疗性糖蛋白的清除，例如凝血或纤维蛋白酶、激素、细胞因子、血清蛋白酶和溶酶体酶。这些蛋白质包括FVIII、纤溶酶原激活物（t-PA）、干扰素-g、EPO、促甲状腺激素、b-葡萄糖脑苷脂酶（GCase）、溶酶体酸性脂肪酶（LAL）和 β-葡萄糖醛酸酶。ASGPR 可以识别双触角、三触角和四触角的聚糖，而 ManR 可以与低聚甘露糖或杂合型聚糖相互作用。当它们与ManR 结合后，发生受体介导的内吞作用，将药物从血清中吸收到细胞内溶酶体中，从而被各种蛋白酶和糖苷酶降解。

从人胎盘中纯化的 GCase 含有约 41%的完全唾液酸化的双触角和三触角聚糖，30%的部分唾液酸化双触角或三触角复合物型聚糖，9%杂合型和 20%低聚甘露糖聚糖[12]。在静脉注射药物后，通过肝细胞将药物从循环系统中清除，进入肝脏降解，半衰期为 21 min。然而，去唾液酸化的复合型或杂合型的聚糖，导致药物的血清半衰期减少至 1.2 min，清除率增加超过 17 倍。当末端为唾液酸、半乳糖时，胎盘 GCase 的 GlcNAc 依次被糖苷酶去除，蛋白质的血清半衰期减少至 2.3 min。

治疗 Wolman 病和胆固醇酯病的重组 LAL，分别由巴斯德毕赤酵母（phLAL）和 CHO 细胞（chLAL）产生。phLAL 的 N-聚糖是寡甘露糖结构，主要是 Man8 ~ 12，而来自 chLAL 的是唾液酸化和非唾液酸化复合物、低聚甘露糖、磷酸化低聚甘露糖的混合物。当小鼠注射 phLAL 和 chLAL时，可以检测到药物在全身多器官巨噬细胞的分布[13]。

EPO 分子含有 3 个 N-连接聚糖和 1 个 O-连接聚糖。蛋白质活性和唾液酸含量之间存在线性关系，这可能与它们在 ASGPR 介导的清除能力有关。去除 3 个 N-糖基化位点中的任何一个，但不去除 O-糖基化，降低了蛋白质的体内活性但不会降低其体外生物活性。另外，N-糖基化也影响聚乙二醇化重组蛋白 EPO 的 PK 特性。

因此，糖基化的影响水平取决于单个蛋白质中存在的特定聚糖结构的相对量，例如低聚甘露糖、无唾液酸杂合体或复合型聚糖。聚糖的亲和力和特异性表现也影响重组蛋白与聚糖结合蛋白的相互作用。因为 ASGPR 和 ManR 在肝脏中都很丰富并且参与清除，所以最小化糖基化含量，包括末端半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、GlcNAc 和甘露糖，仍然是设计治疗性蛋白质以获得最佳效果的主要策略[14]。

糖工程应用也可以降低体内蛋白质清除率。具有 2 个额外 N-糖基化位点的重组 EPO 变体可延长药物半衰期。该变体可以延迟 3 倍血清半衰期，并增加其体内活性。将 N-糖位点引入重组 FGF21 中，引入的糖基化可能由于空间位阻，阻止血清蛋白酶的降解，因此增强药物的血清稳定性。糖基改造蛋白的 Fc 融合物进一步增加血清半衰期，HEK293F 细胞瞬时表达的 Fc-FGF21 糖变体含有低聚甘露糖，而由稳定转染 CHO 细胞产生的相同蛋白，维持正常程度唾液酸化，没有显著量的低聚甘露糖。后者显示出比前者更长的血清半衰期。

3 N-糖基化对蛋白质免疫原性的影响

免疫原性是另一个与药物安全性相关的重要特性。重组蛋白的免疫原性导致过敏反应或药效下降。许多因素可以影响免疫原性，包括蛋白质序列变异、糖基化、变性和聚集等。

具有非人类聚糖的重组蛋白可能被血清中存在的抗体——天然抗体群体的成分识别。这些抗体包括针对 α-1,3-连接的半乳糖（α-Gal、半乳糖和 α-1,3-半乳糖），N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc），b-1,2-连接木糖和 α-1,3-连接岩藻糖，这些聚糖成分通常存在于由非人类甚至非哺乳动物物种所表达的重组糖蛋白中[15]。鼠细胞系（SP2/0 和 NS0 细胞）表达的重组蛋白通常含有大量的 α-Gal。人血清中含有丰富的针对 α-Gal 的抗体，但是人类糖蛋白上不存在 α-Gal，因此含有 α-Gal 的聚糖的重组蛋白会被机体快速清除。据报道，西妥昔单抗在临床中的不良免疫反应与小鼠骨髓瘤细胞系中产生抗体的 N-聚糖中的末端 α-Gal 相关。在许多患者的血清中发现 α-Gal 特异性 IgE 抗体，甚至在治疗前对西妥昔单抗具有超敏反应。抗 α-Gal-IgE 介导的过敏反应与大多数不良临床事件有关。从 CHO 细胞系表达的 CTLA-4-Fc 融合蛋白中，α-Gal 的存在是由于 α-1,3-半乳糖基转移酶的表达。然而，与通常鼠细胞系产物相比，从 CHO 细胞表达的蛋白质中 α-Gal 表位的水平通常较低。

除了非人类聚糖外，重组蛋白中的人样 N-聚糖也可能引发免疫反应。在人免疫细胞中，特别是先天免疫系统的细胞中，存在许多聚糖结合蛋白，包括 Siglecs、半乳糖凝集素受体（CLR）和 C 型凝集素样受体（CTLR）。例如，含有 C 型凝集素样受体位于包括 DC 和巨噬细胞等细胞上。它们可以结合许多特定聚糖，包括来自病原体的非人聚糖和类人聚糖，例如寡甘露糖和岩藻糖基化的复合型聚糖。CLR 通过抗原摄取和呈递给 T 细胞来增强免疫应答或免疫耐受性，在抗原呈递细胞上有重组蛋白的受体，例如属于 CLR 的 ManR。含有潜在免疫表位的受体介导的内吞蛋白可以在溶酶体中降解，通过 T 细胞的主要组织相容性复合蛋白递呈抗原。Dasgupta 等[16]研究了低聚甘露糖对重组治疗性蛋白质——人凝血 FVIII 的免疫原性。FVIII 导致高达30% 的临床患者出现抑制性抗药物抗体，导致药物效力降低。有研究发现，寡甘露糖可能导致 T 细胞活化。此外，还有其他可能导致 FVIII 免疫原性的原因，如基因突变、蛋白质聚集、酪氨酸硫酸化、非人类糖基化和血管性血友病因子。低聚甘露糖介导免疫反应可能是糖蛋白质免疫原性主要原因[17]。

人类的免疫反应可能与其他动物的免疫反应不同，这可能是由于氨基酸序列，定位和许多免疫相关受体（包括聚糖结合蛋白）的差异。不同的 N-聚糖与特定的内吞聚糖结合蛋白相互作用，促进糖蛋白被摄入人抗原呈递细胞内。蛋白质降解后，含有免疫表位的肽由 CD4+T 细胞上 T 细胞受体的主要组织相容性复合物 II 类分子呈现。在该过程中，聚糖结合蛋白可以通过人抗原呈递细胞中的不同细胞内信号传导途径增强或抑制 T 细胞活化，促进炎症因子或抗炎症因子的释放。

4 结论

N-糖基化对蛋白质稳定性、PK 和免疫原性的影响密切相关。缺失聚糖可能导致蛋白质聚集，增加血清对药物的清除率。蛋白质变性可以暴露免疫表位以诱导抗药物抗体，导致血清半衰期缩短。非人类聚糖或聚糖结合蛋白介导的 T 细胞活化可以促进不良免疫应答和蛋白质快速清除[18]。

关于糖基化对蛋白质的影响研究已有几十年，现在研究者通过糖基化工程对这一关键质量属性进行改变。一些重大科学问题尚未完全解决，阻碍了蛋白质糖工程的广泛应用。如：均一化聚糖对单个蛋白质属性的影响，天然蛋白质聚糖结构和重组表达结构差异对蛋白质属性的影响。一些聚糖可以对蛋白质的功能产生显著影响，例如，NK 细胞中 FcgRIII 中的寡甘露糖，与非岩藻糖基化抗体的高亲和性相互作用。最后，有必要进一步破解与糖科学相关的知识和技术。N-糖基化研究必将加速治疗性蛋白质的优化，并在系统化、工程化中得到体现。

N-糖基化是自然界中蛋白质主要的翻译后修饰。包括抗体在内的大多数治疗性蛋白质都含有 N-糖基。越来越多的证据表明 N-聚糖在这些蛋白质的结构和功能中起着重要作用。这里综述了 N-糖基化对蛋白质稳定性、PK 和免疫原性的影响机制。蛋白质稳定性的增强归因于 N-聚糖与相同分子中的蛋白质主链的相互作用或由于聚糖的存在而增加的亲水性，聚糖可保护疏水性或易聚集氨基酸残基，进而影响药物的血清半衰期。N-糖基化是影响药物免疫原性和稳定性的重要因素之一。在研究和开发过程中应该对各种治疗性蛋白的 N-糖基化进行广泛研究和优化，为保证药物稳定性以及用药安全提供有力保障。

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“重大新药创制”国家科技重大专项（2017ZX09306010）

王志明，Email：wzm3994@163.com

2019-07-30

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.010