酶联免疫法检测中长链结构甘油三酯中的酶残留量

李海波，李康强，蔡鸿飞，龙海林，袁诚，许文东，张懿，杨阳

技术与方法

酶联免疫法检测中长链结构甘油三酯中的酶残留量

李海波，李康强，蔡鸿飞，龙海林，袁诚，许文东，张懿，杨阳

510240 广州，中药提取分离过程现代化国家工程研究中心/广州白云山汉方现代药业有限公司

中长链结构甘油三酯是一种应用度较高的改性油脂，既避免了中链甘油三酯易引起酸中毒和酮血症状，又克服了长链甘油三酯免疫功能方面的缺陷和吸收缓慢的缺点[1-2]。中长链结构甘油三酯在一定程度上弥补了单一脂肪酸的供能和营养性上的缺点，也有利于氮平衡和提高单核吞噬细胞系统的功能、减轻免疫系统并发症[2-3]。结构脂质的生产方法主要有化学法和酶法等[4]。化学法往往存在着有机溶剂用量较多、反应温度高、产物难以控制等缺点。而酶法合成过程反应条件温和，安全性好，产物专一性强，能合成特殊的结构脂质，可以满足消费者在医疗和营养方面的需要，故酶法在中长链结构甘油三酯的合成应用中逐渐成为研究的热点[5]。

脂肪酶是一类特殊酯键水解酶，可催化由不同底物组成的水解和合成反应。中长链结构甘油三酯催化合成结束后需要除去脂肪酶，否则在长期存放的过程中，脂肪酶会催化酯键水解，导致游离脂肪酸的增多，以及分子内的中长链残基发生变化，严重影响产品质量的稳定性[6-7]。另外还会提高人体对中长链结构甘油三酯过敏的风险。目前，脂肪酶的测定方法有平板法（主要应用于产脂肪酶菌种的筛查及批量酶样品的快速测定，但误差较大、耗时长），滴定法（适用于乳制品中脂肪酶活力的测定，但耗时长、误差大、会有假阳性结果、判断滴定终点困难），色谱法（适用于脂肪酶的确证及活性精确定量，但设备昂贵，不适用于大量样品）[8-11]。国内外尚未有关于甘油三酯中的低含量脂肪酶检测的报道，本研究通过制备脂肪酶抗体-脂肪酶抗原-酶标抗体复合物，与 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）反应显色的原理，建立中长链结构甘油三酯中酶残留量的酶联免疫测定法，并重点验证该检测方法的稳定性、准确性，以期为监控中长链结构甘油三酯的质量稳定性提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Multiskan FC 酶标仪购自美国赛默飞公司；BJPX 生化培养箱购自山东博科科学仪器有限公司；CS-101-A电热鼓风干燥箱购自上海昕仪仪器仪表有限公司。

脂肪酶酶联免疫分析试剂盒购自江苏晶美生物科技有限公司；中长链结构甘油三酯样品经酶法酯交换反应实验制备所得。

1.2 方法

1.2.1 抗体-抗原-酶标抗体复合物的制备及显色反应 采用纯化的脂肪酶抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入脂肪酶，再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的脂肪酶抗体结合，形成脂肪酶抗体-脂肪酶抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

1.2.2 中长链结构甘油三酯中酶残留量检测方法的建立

1.2.2.1 标准曲线的绘制 试剂盒从冷藏环境中取出后室温平衡 15 ~ 30 min，以 150 μl 的原倍标准品加入 150 μl 标准品稀释液配制成浓度为 32 ng/L 的标准品溶液，对倍稀释 4 次，使终浓度分别为 32、16、8、4、2 ng/L。分别在酶标包被板上设置空白孔（空白对照孔不加标准品溶液，其余各步操作相同）、标准孔，并记录位置。在标准品孔上准确加样 50 μl，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，用封板膜封板后置 37 ℃温育 30 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 s 后弃去，如此重复 5 次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外。重复温育和洗涤操作，每孔先加入显色剂 A 50 μl，再加入显色剂 B 50 μl，轻轻振荡混匀，37 ℃避光显色 10 min。每孔加终止液 50 μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。以空白孔调零，450 nm 波长依序测量各孔的值。测定应在加终止液后 15 min 以内进行。

以标准物的浓度为横坐标，值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与值计算出标准曲线的直线回归方程，将样品的值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.2.2.2 方法学验证实验

1.2.3 样品脂肪酶测定 中长链结构甘油三酯样品经过滤等预处理后，用样品稀释液稀释 5 倍，取 50 μl 样品加于酶标板样品孔，其他步骤与 1.2.1 操作步骤相同。测定后各孔的值减去空白孔的平均值，计算平均值，按标准曲线计算，即得到中长链结构甘油三酯样品中脂肪酶的浓度。

2 结果

2.1 标准曲线

以标准品浓度为横坐标，空白孔调零，标准品的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（图 1）。脂肪酶在 1.0 ~ 32 ng/L 浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为：y = 0.0368x + 0.0130，相关系数2= 0.9990。

2.2 方法学验证实验结果

2.2.1 脂肪酶准确性与回收率实验 如表 1 所示，酶联免疫法检测脂肪酶的回收率分别为 100.81%、96.01%、101.43%、95.52%，范围均在 100% ± 10% 以内，相对标准偏差 RSD 分别为 1.24%、2.30%、1.62%、3.32%，RSD 值均小于 5%，说明本研究方法检测中长链结构甘油三酯中脂肪酶的准确性和回收率较好，并且稳定性较好[12]。

图 1 脂肪酶标准曲线

2.3 中长链结构甘油三酯中的脂肪酶含量检测

中长链结构甘油三酯样品经过预处理后，稀释加样检测，将值按标准曲线计算得到样品中脂肪酶的含量。样品 S3 脂肪酶含量为 3.53 ng/L，样品 S4 脂肪酶含量为 6.11 ng/L，样品 S5 脂肪酶含量为 5.02 ng/L，经稳定性试验验证后，中长链结构甘油三酯中脂肪酶残留量在合理范围内。

3 讨论

酶催化合成法是中长链结构甘油三酯制备的常用方法。中长链结构甘油三酯具有优越的营养特性和健康功能，被广泛应用于医药、食品、特殊营养等领域，但同时对其质量要求也越来越严格。中长链结构甘油三酯中残留的脂肪酶不仅增加人体致敏性风险，还会水解甘油三酯，严重影响产品质量的稳定性[13]。因而，中长链结构甘油三酯中的脂肪酶残留量是其不可或缺的重要检测指标。本研究结果表明，脂肪酶浓度范围在 1.0 ~ 32 ng/L 线性较好，方法学验证表明其重复性、重现性、准确性和回收率较好，适用于检测中长链结构甘油三酯中的脂肪酶残留量。

表 1 准确性与回收率实验

表 2 重复性实验

表 3 重现性实验

传统的脂肪酶含量检测方法存在难以检测低浓度，与酶联免疫法相比，价格昂贵，操作复杂等缺点[14]。本研究采用酶联免疫反应显色原理建立检测中长链结构甘油三酯中脂肪酶的方法，免疫学检测方法通常具有灵敏度高、特异性强、方便快捷的特点[15]。本方法与平板法、色谱法和荧光分析法相对比，在确保检测结果准确性和稳定性高的同时，实验操作简单，贵重仪器少，样品用量少，检测限较低。本方法可为脂肪酶的高通量、方便快捷的现场检测提供技术支撑，为中长链结构甘油三酯的质量控制、研究开发提供科学检测手段。

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蔡鸿飞，Email：caihf@byshf.com

2019-08-28

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.012