实验动物管腔内皮损伤造模研究进展

2020-01-09环璐瑶梁海燕

中日友好医院学报 2020年6期

环璐瑶，梁海燕，凌斌

（1.北京中医药大学研究生院，北京 100029；2.中日友好医院妇产科，北京 100029）

输卵管妊娠约占异位妊娠的95%[1]，目前保守治疗主要为取胚术，但该方法有输卵管发生破裂的风险，为保证患者的生命安全，多数情况只能采取输卵管切除的方法，影响到生育能力[2～4]。输卵管妊娠取胚术后输卵管的损伤是目前临床面临的问题，其功能的恢复也亟待解决，因此建立一个相似的动物模型对于后续治疗的研究至关重要。现针对国内外常用的输卵管损伤模型，同时结合体内其他管腔（支气管、血管）损伤的动物模型及特点，综述如下。

1 输卵管炎模型

输卵管是盆腔炎症性疾病的主要发病部位，输卵管炎多由病原体感染引起，可分为内源性和外源性2 类：内源性病原体指阴道内寄生的菌群，主要为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、溶血性链球菌等；外源性病原体包括沙眼衣原体（chlamydia trachomatis，Ct）、支原体、淋病奈瑟菌等[5]。基于输卵管炎的发病机制，生物造模法应运而生，根据病原体的选择可将其分为特异性和非特异性。除生物法外，还有部分报道使用化学法也可成功获得输卵管炎模型[6]。

1.1 生物方法

1.1.1 特异性病原体

向动物输卵管内注入特异性病原体是目前国内外最常用的输卵管炎造模方法，Ct 则是最常用的病原体类型，Ct 感染后输卵管组织出现纤维化改变，当病原体进入黏膜层上皮细胞后，以始体大量繁殖，并致黏膜层上皮细胞纤毛消失，破坏输卵管蠕动及纤毛摆动功能，部分细胞核固缩、碎裂，明显的纤维母细胞增生后导致组织纤维化，急、慢性炎症细胞浸润及纤维增生，从而导致输卵管粘连以及盆腔炎症[5]。Liao 等[7]用含1×107IFU 的MoPn 感染液50μl通过阴道内接种感染，4 周后成功建立输卵管炎模型。王柳苑等则[8]提出，不同基因型的Ct 对输卵管的影响也存在差异，H 型和K 型Ct 感染小鼠后可能更容易逃避宿主生殖道黏膜上皮的免疫监视和免疫反应，进而导致更严重的输卵管扩张积水、纤维组织增生、管腔变窄等。

1.1.2 非特异性病原体

向输卵管内注入细菌，主要通过其产生的毒素和侵袭性酶类引起炎性反应，炎细胞浸润、组织增生，从而引起炎性粘连，导致局部狭窄或扩张。根据病原体使用的类型数量可将其分为单一菌和混合菌。①单一菌：Li 等[9]将大肠埃希菌细菌原液用生理盐水稀释成浓度为3×108/ml 的大肠埃希菌混悬液，在建模后第15d 表现出典型慢性输卵管炎特征；胡喜姣等[10]则是利用4×109/ml 金黄色葡萄球菌成功造模。②混合菌：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌按2：1：1用无菌水稀释，制成浓度为3×109/ml 的混合菌，于术后第20d 成功复制输卵管炎模型[11]。使用细菌构建输卵管炎模型成功率较高，但要注意其接种的菌量，在输卵管内接种菌液量相对固定的条件下，菌液的浓度决定了动物感染的细菌量，浓度过低不易感染或感染率低，浓度过高易形成败血症，造成动物死亡。

1.2 化学方法

此类方法是通过向输卵管内注入化学制剂引起炎症反应进行造模，使用的制剂有苯酚胶浆及盐酸，以上两者皆为化学性腐蚀烧伤剂，苯酚胶浆曾经在我国临床上的输卵管绝育手术中作为黏堵剂使用，将此类化学致炎剂注入输卵管后会引起输卵管管腔扩张、上皮细胞增生和炎性细胞浸润，严重者可引起盆腔炎，因此也是制作盆腔炎模型的方法之一[6]。许浩等[6]向输卵管缓慢注射25%苯酚糊剂0.02ml，15d 后造模成功。

虽然化学性烧伤致炎的病理结果与人类输卵管炎一致，但两者的感染途径不同，并且此类方法可能会导致输卵管严重损害甚至阻塞，目前已较少应用。由此可见，在输卵管炎模型的构建中生物法能较好地模拟人生殖道感染过程，将病原微生物注入输卵管内的操作也接近人类输卵管炎症感染的途径，在这种情况下建立的输卵管炎症模型也更具有信服力，更能真实地在动物体内还原人类输卵管炎症的发生情况。

2 支气管损伤模型

支气管由3 层组织组成：①黏膜层上覆有黏膜，主要为假复层柱状纤毛上皮细胞； ②黏膜下层为疏松结缔组织，其中含有较多的气管腺；③外膜由透明软骨和纤维组织构成。目前关于支气管损伤的模型主要有慢性阻塞性肺疾病（chronic obstruct pulmonary disease，COPD）、支气管狭窄及急性肺损伤（acute lung injury，ALI）等，常用的构建方法可以根据性质划分为生物、物理及化学3 类：

2.1 生物方法

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁中主要的促炎糖脂成分，将LPS 注入支气管内主要用来建立ALI 模型。LPS 的介入会导致肺泡毛细血管内皮细胞、肺泡上皮细胞和肺基质的急性弥漫性损伤，其实质是肺内各种炎症细胞的激活和浸润以及一系列炎症介质的释放，导致肺损伤。同时更多的炎症细胞被激活，炎症介质或细胞被释放，进一步放大和加强了肺损伤信号，形成炎症瀑布效应[12]，与ALI 临床表现相似。也有研究表明，吸入途径诱导的ALI 能更好地模拟人类疾病状态。该模型具有时间周期短等优点，但建模过程中需严格控制LPS用量，用量过大可能会造成支气管内皮不可逆性损伤。

2.2 物理方法

此类方法是通过机械力直接损伤支气管内皮，是建立支气管狭窄动物模型的常用方法。陈思等[13]将SD 大鼠麻醉后，颈前区用脱毛膏被毛，以0.5%碘伏消毒，做长约3cm 的颈前区正中切口，钝性分离颌下腺及气管旁肌肉，左右两侧分别以弯头止血钳牵拉气管旁肌肉以暴露喉和气管，在距环状软骨0.4cm 处横向切开气管，切开2/3 周径。从切口处向远端伸入1.5mm 直径硬质尼龙刷来回刮刷10 次以刮除黏膜，摩擦区域长约1cm，可成功构建支气管狭窄动物模型。该方法能较好地模拟临床上常见的继发于插管或气管切开等的黏膜机械损伤，但此模型也有一定的局限性，由于大鼠气管管腔面积基数小，无任何治疗的情况下肉芽组织在造模后d8 几乎充满管腔，导致气道完全闭塞、动物窒息死亡。因此，该模型仅适用于狭窄早期阶段（肉芽组织增生期）的研究[13]。

2.3 化学方法

在构建COPD 的动物模型上，基于该病常见的危险因素 “吸烟”，研究者通过将动物暴露于烟草烟雾（cigarette smoking，CS）中模拟香烟损害气管的机制[14，15]。气道上皮细胞是CS 的主要靶细胞[16]，其破坏机制可能是：①CS 中含有大量的活性氧自由基（ROS），会导致肺部氧化应激和损伤，ROS 到达肺部后触发其他自由基的产生和脂质过氧化反应，出现明显的炎性细胞浸润；②CS 的暴露可以抑制内源性抗蛋白酶的活性，并募集和激活肺泡巨噬细胞和中性粒细胞；③增加肺内皮屏障的通透性，并导致内皮细胞活化，气管上皮纤毛密度显著降低，部分脱落至完全脱落，上皮细胞空泡变性，典型结构消失，同时也会导致肺内皮细胞凋亡[17]。Magnani 等[14]将Wistar 大鼠放在1 个与吸烟装置相连的干净的房间里，每次放入5 只。每次向房间内注入CS 30min，在第1 周，在早晨以5 支烟/30min/d（7d/周）的速度释放；从第2 周开始，增加到10 支/30min，直到研究结束可成功建立COPD 模型。CS 诱导的模型是模拟COPD 最常见的模型，因为它们在生理上与人类疾病相似，但此方法也存在许多不足：首先是时间和能量消耗，造模周期较长；其次，由于同一刺激物的剂量、时间和动物品系可能会导致不同的结论，暴露方法没有统一的标准。

3 血管内皮损伤模型

3.1 物理方法

此种造模方法的根本机制是人为对血管内皮层产生机械力，从而引起内皮损伤或功能障碍，根据介入方式的不同可以分为手术损伤和药物损伤，手术损伤是通过球囊或金属丝直接拉伤并剥脱内皮，药物损伤是通过药物升高动物血压，高血压使血管壁承受的血液流体力学发生改变，引起血管壁的病理改变，并影响血管内皮细胞的结构与功能，反过来，内皮功能障碍又加重了高血压的发展，形成恶性循环。

3.1.1 手术损伤

王学宁等[18]将Si Pham 教授前期经验改进，对球囊进行充水排水试验；大鼠麻醉后，碘伏消毒，纱布铺单显露手术部位：于腹部正中做一约4cm 纵切口，撑开腹壁及腹膜，用棉签及镊子钝性分离腹主动脉及双侧髂动脉，分别在腹主动脉发出肾动脉后及分为左、右髂动脉前，各穿1 根1号慕丝线以便提拉腹主动脉；皮下注射肝素300U/kg，轻提2 处牵线并分别用微创动脉夹钳夹腹主动脉，用尖刀在两动脉之间的腹主动脉前壁做一长约2mm 纵行切口；用镊子轻夹球囊杆部将球囊插入动脉切口，开放远端血管夹，将球囊向远处推送，利用牵线将球囊经过髂动脉分叉导入左髂动脉，推至遇阻力不能继续前进时停止；助手将球囊注水使其膨胀，并维持压力为1.5 个大气压（1 个标准大气压=101.325kPa），术者将球囊缓慢回拉，直至退入腹主动脉内，助手将球囊排水，术者再次上述方法将球囊插入至左髂动脉以远；如此重复3 次；损伤完毕，将球囊缓慢撤出至切口附近，用微创血管夹阻断远端腹主动脉，再将球囊完全撤出，可成功构建血管内皮损伤模型。也有学者[19]通过电刺激成功建立模型。通过机械力使血管靶段内皮层彻底剥脱，是目前应用最多的动物模型。此外，这种方法还具有可逆性、血栓形成率低、死亡率低及术后总体情况良好等优点。但操作难度较大，手术过程中容易在分离动脉时碰伤周围的静脉血管而引起大出血；不论是球囊拉伤还是电刺激损伤都难以控制血管损伤的程度，对术者要求较高。

3.1.2 药物损伤

药物损伤是通过药物的介入升高动物血压对血管壁形成生物机械力，损伤血管内皮，Wei 等[20]使用肾上腺素构建血管内皮损伤模型，于每日10 点、14 点及18 点皮下注射稀释的盐酸肾上腺素（0.67mg/ml，0.5ml/kg），14d 后可成功建模。其机制可能是：①肾上腺素具有强烈的血管收缩作用，皮下注射肾上腺素导致血压升高，而急剧的血压升高则会产生机械损害，可导致血管内皮细胞通透性增加、形态及数量异常等血管壁损伤；②肾上腺素的诱导以及血管内皮细胞的损害可以引起肾素-血管紧张素系统失衡，血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）分泌增加，而AngⅡ可增加血管内皮细胞的通透性，促进脂质沉积和有害物质的侵袭，最终导致血管内皮细胞功能受损，AngⅡ还可通过NF-κB 途径加重血管内皮细胞的炎症反应，导致血管内皮损伤[21]。该造模方法与人体因高血压引起血管内皮损伤的机制相似，且具有操作简单、成功率高、同一性强等优点，是研究高血压相关血管疾病的理想动物模型。

3.2 化学方法

该建模方法的机理是利用同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）诱导血管内膜变性、脱落，主要用于模拟人类的动脉硬化状态。Hcy 是一种含硫的血管损伤氨基酸，在体内是甲硫氨酸循环的代谢产物，也是许多甲基化反应及能量代谢过程中一种重要的中间物质[22]。其损伤机制可能是：①产生ROS，进而导致脂质过氧化，降低膜流动性，破坏细胞完整性，导致内皮细胞凋亡或死亡[23]；②增加血小板的聚集率及黏附性，导致血栓形成，促进AS 的发展。国外学者研究证明，Hcy 是动脉内膜增厚和粥样斑块形成的独立危险因[24]。所以应用Hcy 制作动物模型，能成功模拟人类因AS 导致的血管内皮损伤状态，目前应用较为广泛。