同种异体骨植骨临床应用与研究进展

滕沙格 陈 哲 范佳俊 陈岩松

人体骨骼具有自我再生和自我修复功能，这使得受损器官能够完全恢复到其损伤前的组成、结构和功能[1]。然而，在病理性骨折或大段骨缺损时，骨的修复重建往往失败，导致骨延迟愈合或不愈合。这些患者常常需要进行骨移植处理，然而各种骨移植材料仅能体现骨诱导、骨传导、骨生成中的一种或数种作用[2]。同种异体骨移植是从骨库取同种异基因捐赠者的骨，植入到患者骨质缺损部位，其来源丰富，不受形态、大小限制，生物活性良好，显示了良好的骨组织修复的效果。据文献报道，同种异体骨移植仍有较高的失败率[2-5]，主要表现为植骨延迟愈合、不愈合及疲劳骨折，免疫反应及骨吸收。本文对同种异体骨植骨的临床应用和相关研究进展作一综述。

1 同种异体骨的种类

1.1 新鲜的同种异体骨块 同种异体骨移植与实质性脏器移植不同，可以没有存活的细胞。为减少免疫反应，尽量刮除新鲜骨块软组织、骨膜和骨髓等，用高压反复冲洗骨髓腔。当然，这种机械的方法并不能完全去除细胞成分，移植后免疫排斥反应较明显，各种传染性疾病传播的可能性也较大，故较少应用。

1.2 深低温冷冻骨 先将获得的同种异体骨表面的肌肉、韧带、骨膜、软骨等尽量彻底剔除，切成各种形状和大小的移植骨块。对需要保留关节软组织的关节移植物，尽量去除骨膜，保留肌腱、韧带和关节囊。用无菌生理盐水或加抗生素的生理盐水加压冲洗，去除骨髓组织。制备过程和使用期间须重视细菌培养。用8%～10%的2-甲基亚砜或甘油浸泡30min 后进行无菌包装，采用逐渐降温法深冻处理。深冻法适用于各种骨移植材料的保存，尤其是要求保留软骨活性的带关节的大块骨块。它对移植骨的生物学和生物力学性能无明显的影响，但灭菌不彻底。深冻法保存的同种异体骨移植后，也会产生免疫反应，但以慢性排斥反应为主。

1.3 冷冻干燥骨 将新制成的深冻骨放入真空冷冻干燥机中冻干24h（使其水分少于5%），再装入灭菌塑料袋中真空密封，环氧乙烷灭菌，或采用钴60 辐照灭菌（25kGy），室温无菌封存。常温下可保存5 年。应用前一般要经水化，即复水处理。优点是常温保存、便于运输等。缺点是骨块的骨强度受到明显影响。

1.4 脱钙骨 盐酸脱钙骨基质具有很强的骨诱导能力，可以诱导血管周围的未分化间充质细胞、骨髓基质细胞向成软骨细胞或成骨细胞分化。在同种异体脱钙骨处理基础上，又制成脱钙骨基质（demineralized bone matrix，DBM）、骨基质胶原（Bone matrix collagen，BMC）等品种。其最大优点在于塑形方便，具有异位骨诱导活性。缺点是力学强度低，只能作为充填材料，不适用于修复负重部位。

1.5 自消化抗原去除骨 自消化抗原去除骨（Autolyzed Antigen-extracted Allogeneic bone，AAA 骨）。先将同种异体骨进行脱脂（用1:1 氯仿甲醇液混合液）10h，以提取细胞膜上的移植抗原。然后进行脱钙（0.6mmol/L 盐酸，2h）。再在中性磷酸缓冲液中孵育，以激活内源性酶系统进行抗原的自身消化和提取。缓冲液中加入巯基蛋白酶可抑制骨形态发生蛋白酶（Bone Morphogenetic Protein，BMP），使BMP 免受破环。最后进行冻干和灭菌处理。灭菌可采用钴60 辐照（15～25kGy）和环氧乙烷（1600mg/h），4℃左右保存。使得同种异体骨不但降低抗原性而且增强骨诱导能力。其骨诱导活性来自于骨的脱钙作用和与基质有关的BMP。

1.6 脱蛋白骨 分别采用20%过氧化氢和乙醚法制备的脱蛋白骨（deproteined bone，DPB），可较彻底的去除材料中主要的免疫原性物质，即蛋白质和脂质成份，避免其植入体内后引起排斥反应。封装后，液态环氧乙烷（化学纯）消毒。由于制作材料来源于松质骨，其孔隙率高，孔径在100～300μm2左右，较好的保留原骨组织的三维孔隙一网架结构系统。该材料因网架有效空间大，保证良好的骨传导性，为细胞的贴附、生长、增殖和成骨提供理想场所。

2 同种异体骨植骨的并发症及预防、处理

2.1 感 染 感染可导致骨髓炎和骨溶解，延缓骨愈合，降低临床效果[6-7]。整体上同种异体移植的感染率约为1.2%～9%[5，8-10]（骨肿瘤术后患者感染发生率为8%[9]，大段同种异体骨移植后感染率可达9%[8]）。同种异体骨污染最常见的病原体为凝固酶阴性葡萄球菌[11]。数据分析显示，移植同种异体骨感染艾滋病毒的概率仅为160 万分之一，低于输血感染艾滋病毒的概率[12]。约75%的移植物感染发生在同种异体移植后4 个月内[11]。Wu 等[10]发现同种异体移植物的阳性培养结果与随后的手术部位感染无关，术中对移植物的培养是多余的，并不能预测术后感染的发生[13]。胫骨骨干重建感染风险高的重要原因之一为软组织覆盖有限，肌瓣移植有助于降低风险，骨皮质切除程度也与感染率密切相关，原因可归于广泛软组织切除和手术时间延长[14]。Aponte-Tinao 等[8]回顾了60 例同种异体骨移植术后发生的感染病例，其中仅有18%的患者通过抗生素和清创治愈，82%的患者进行了翻修手术，移除了同种异体移植物，并置入带抗生素的骨水泥填充物（成功率68%），感染控制后再植入同种异体骨、假体，或进行截肢，这些病人二次移植失败率较高（34%）。

临床应用最广泛的灭菌剂为环氧乙烷，其通过对微生物的蛋白质、DNA、RNA 产生烷基化作用，主要优点为杀菌谱广，杀菌力强，毒副作用低，但其无法穿透骨皮质[12]。其他化学处理如过乙酸-乙醇等同样缺乏对深层的完全渗透[6]，盐酸和二甲基亚砜则对一些逆转录病毒无效[12]。而放射灭菌作用原理主要为射线激发的电子使DNA 分子键断裂或引起细胞内水的解离，但需控制放射剂量来防止骨组织强度的下降。热力灭菌也是医学常用的灭菌手段之一，Folsch 等[15]研究了加热对松质骨拔出强度的影响，发现松质骨的热消毒可以保持临床所需的拉伸强度。目前这种方法较少应用于同种异体骨。临床上应注重产品的灭菌、加强术中的无菌操作及受体易感因素的管控。经过适当的筛选和制备程序，同种异体骨传播疾病风险可降到最低。

2.2 无菌性骨不连、再骨折 骨不连，是指术后6 个月，同种异体移植骨和宿主骨接口处没有任何骨桥性骨小梁组织通过。再骨折，是指术后同种异体骨移植区新出现不连续或断裂，这些并发症一般发生在术后3 年内。Delloye 等[5]在同种异体骨关节翻修、骨肿瘤术后骨移植病例回顾性分析中发现，骨不愈合是最常见的并发症（35%），移植物骨折是第二常见的并发症（16.4%）。Gharedaghi 等[9]统计了113 例接受了大段骨肿瘤切除和同种异体骨移植的患者（多数患者为接受放疗、化疗后），其中5.9%的患者出现移植骨骨折，5.9%的患者出现骨不愈合。

引起无菌性骨不连的主要因素包括粉碎性骨折、骨缺损程度大、周围软组织血运状况差。局部力学稳定性是骨不连主要因素，而不是免疫反应[15-16]。总体来说大段同种异体骨的不愈合率和骨折率大于其他形式的同种异体骨植骨。在大段骨移植中，影响骨愈合最重要的变量是重建方式，相比整段关节移植及结合金属固定物移植等方式，单纯同种异体骨作为骨间桥接的方式具有最高的骨不连率（优势比为12.26～8.77）[5]。大段同种异体骨结合钢板比结合髓内钉更容易发生骨折[17]。结构性异体骨的生物力学性能极为重要，而各种加工方法均可不同程度影响移植骨强度、弹性模量、最大应力、最大吸收能量等承载能力的量度指标，加之病人过早负重及内固定不够坚强，引起再骨折。新鲜人骨皮质的强度和冻融人骨皮质并无明显差异，但冻干处理可使骨发生纵向微细骨折，增加移植骨的脆性，对移植力学性能产生显著影响。冻干骨移植前的再水化可以恢复其部分性能[18]。其次，对异体骨进行大剂量γ 射线可以破坏骨胶原分子间的交连[19]，当γ 射线照射剂量达到50J/g 时，冷冻、冻干皮质骨的抗压强度和硬度均有明显降低，否则无明显影响[20]。经过消毒灭菌、消除抗原处理的同种异体骨几乎不存在细胞，骨诱导及骨生成性能明显降低，植骨后遗留部分未转变的移植骨，以及后期因此发生的过度吸收，均可造成愈合时间延长和再骨折。另外，同种异体骨的血管重建是愈合过程的重要部分，血管化不良也是同种异体骨移植后骨折、不愈合的主要原因之一[21]。血管重建的过程受到手术时间的延长、软组织损伤以及大量的肌肉或肿瘤的切除等因素的影响。

虽然最新的研究已经提出了很多预防同种异体骨骨不连、再骨折并加快愈合的思路，但大多有待进一步完善和推广。Aronin 等[20]设计的一种新的连续聚合物（FTY720，一种选择性鞘氨醇1-磷酸受体激动剂）涂层系统，被证明显著提高了同种异体骨移植后的机械稳定性，并减少因局部疲劳引起的骨折，其机制包含减少破骨细胞对移植骨的过度吸收和诱导微血管重塑等。而Das 等[21]发现其能通过局部免疫调节改善血管生成-成骨偶联，从而改善移植物血管形成，加速骨组织的形成，以及增强与宿主组织的相容性。姬传磊等[22]使用同种异体骨与带血管自体腓骨嵌套式复合骨并填充β-磷酸三钙，在动物实验中取得良好效果，为增加大段同种异体骨机械稳定性与加快愈合过程提供了一种新思路。Vadalà 等[23]的前瞻性试验表明骨髓细胞浓缩物和富含血小板的血浆有助于增加同种异体骨移植的愈合率，其中骨髓基质细胞起到主要作用。Fernandes 等[24]的动物实验也证明骨髓基质细胞细胞化的同种异体骨，更有利于强度巩固、再塑形、及在结构和形态上重建骨和骨髓。笪虎等[25]在动物实验中，用多聚赖氨酸表面改性后的同种异体骨，通过促进细胞贴附及增长，显著提升了其对兔骨髓间充质干细胞的亲和性。

DBM 因其保留I 型胶原蛋白、非胶原蛋白和骨诱导生长因子，具有骨传导和骨诱导特性，其施加外源性血管内皮生长因子后，可显著加快异体脱钙骨血管重建，加快骨活化[26]。其在脱细胞冻干骨等提供载体支架后可体现不同程度的机械稳定性。

手术干预仍然是骨不连和再骨折的主要措施。牛晓辉等[27]对不愈合接触端通过植自体髂骨移植，均能良好愈合，而进行带血管蒂骨移植的接触端，愈合时间明显更短。对不愈合的四肢骨肿瘤重建患者，则更倾向于自体骨植骨移植。Hu 等[28]的兔模型实验，通过检测实验对象的多项指标，表明负压封闭引流促进兔骨移植血管形成，其中成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）的增加可能是发生这种情况的机制之一。需要指出的是，清理不愈合的接触端，包括瘢痕和部分移植骨，但不损伤周围组织血供，是翻修术的重点。必要时使用带血管蒂的自体骨移植，可明显缩短愈合时间，对接触端进行加压固定也是有意义的。

2.3 过度吸收 理想的同种异体骨移植物愈合过程，涉及新宿主骨对坏死移植物的包裹，其中包含由造血细胞和成骨细胞组成的重塑单元。通过破骨细胞介导的骨吸收以及骨形成，进行爬行替代。于国胜等[29]对同种异体骨在椎体内植骨的病例进行了回顾，发现椎体内植骨量越大，后期形成空洞的可能性就越大。研究者归其主要原因为植骨量过大，而骨折处血循破坏导致爬行替代能力不足；次要原因为异体骨骨诱导能力不足和免疫反应。临床上常常将这类情况归类为萎缩型骨不连。同种异体骨移植后骨吸收发生率为10.78%[9]。由于存在骨缺损，再次植骨是基本治疗。骨吸收缺损较大时，自体、同种骨混合植骨可能是合适的选择。

二膦酸盐及焦磷酸的合成类似物在抑制移植骨吸收上有较大的应用前景。二膦酸盐与骨矿物具有较强的亲和力，吸收后可诱导破骨细胞凋亡。通过添加破骨细胞抑制剂-二膦酸盐，可以在药理学上调节使用BMP 引起的过量骨吸收，而不减少骨形成[30-31]。Seo 等[32]在动物实验中发现，用唑来膦酸盐溶液进行同种异体骨移植的药理修饰，可以降低破骨细胞介导的同种异体骨移植的吸收。

2.4 免疫排斥反应 免疫排斥是指移植接受者的免疫系统识别移植物抗原，对后者进行免疫攻击。植入物发生免疫反应意味着细胞不容易贴附及周围组织长入，不利于植入物周围血管的生长，从而减慢异体骨植入后早期的爬行替代过程，延缓移植骨与宿主骨愈合。骨愈合不良、大量吸收、感染等都与同种异体移植物的免疫反应相关。同种异体骨移植入宿主后引起的免疫排斥反应是以活性淋巴细胞和细胞毒性抗体的产生为特征，主要通过T 淋巴细胞介导的细胞免疫。深度冷冻、冷冻干燥等物理方法，主要使同种异体骨细胞表面的蛋白质失活，从而达到消除或减弱抗原性的目的。

Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）的表达也与免疫排斥相关。其中Toll 样受体4（Toll-like receptors4，TLR4）与多种急性免疫排斥有关，髓样分化因子（myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）则是TRL 信号通路的重要下游分子。Hsieh 等[33]的动物模型实验显示，TLR4 和MyD88 的表达在同种异体骨移植的小鼠中上升，而TLR4 短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）和MyD88 shRNA 则有效抑制了TLR4 和MyD88 表达，表明局部抑制TLR4 和MyD88 可能会降低免疫反应并改善同种异体骨的排斥反应。

良好的加工技术可以使同种异体骨的免疫反应达到最小化。其中，冻干同种异体骨移植所引发的免疫反应为程度较轻、范围局限的慢性免疫排斥反应，对全身的影响较小，对移植骨的愈合没有明显影响。严重的同种异体骨免疫反应则来源于新鲜冷冻同种异体骨的骨膜细胞和骨髓，以及大段关节移植时保留的韧带、肌腱等组织。传统的同种异体骨加工方法尚无法同时做到保留骨生成能力、骨诱导性和肌腱、韧带等组织活力的同时消除免疫原性。但最新的研究也证明很多加工方法的有效性，能在保留同种异体肌腱、韧带等组织活性的同时降低免疫原性。

环孢菌素在抑制器官移植免疫反应中起重要作用。张大伟等[34-35]的兔子模型实验表明，复合环孢菌素同种异体骨愈合速度优于冻干骨，其引发的免疫反应也较弱。FTY720 也可能通过调控局部免疫反应和异物反应的机制促进同种异体移植愈合。

免疫排斥相对难以预防，目前也少有针对性的治疗方法，除了环孢素等应用于非肿瘤患者，大多数大段移植的肿瘤患者并不推荐使用免疫抑制剂。如采取早期引流，维持换药的方法治疗，平均换药时间可达18 日[36]。采用负压引流术则减少换药次数，缩短伤口愈合时间，降低感染发生率[37]。

3 小 结

同种异体骨移植后仍有较多的并发症发生，影响了疗效。发生免疫排斥反应、骨不愈合、骨吸收等并发症的机制，在分子生物学、免疫学层面上仍有较多不明确的区域，值得我们进一步开展基础研究。临床工作中，应严格选择同种异体骨移植的种类、移植方法及其适应证，尽量预防并发症的发生。对并发症的传统处理措施，如冲洗引流、适当抗生素和抗排异药物的应用、重新自体骨和同种异体骨复合植骨、重新内固定、局部伤口换药等，均有不同程度的疗效。积极预防和妥善处理人工骨移植术后并发症，患者的远期预后仍可以得到较大的改善。