柑橘玻璃化法-超低温脱毒技术研究进展

黄 秀 柯甫志徐建国 王 平 聂振朋 孙立方 孙建华

（浙江省柑橘研究所/国家柑橘品种改良分中心 台州 318026)

柑橘类等以营养繁殖为主的植物由于长期的无性繁殖，往往容易感染一种或几种病毒、类病毒及细菌性病害[1]。如柑橘黄龙病、碎叶病、裂皮病、衰退病等，对柑橘生产造成了极大的危害，这些病害通过嫁接代代相传，随着引种和苗木、接穗的流动调运扩散蔓延，是柑橘优质高产的严重障碍[2-4]。目前，对这些病害尚无有效的治疗方法。对带病苗木进行脱毒，建立完善的无病毒苗木繁殖体系，是柑橘产业健康发展的关键。

目前，柑橘无病毒苗木的主要获取方法仍采用传统的茎尖嫁接或茎尖嫁接结合热处理[5，6]。因植物病毒分布具有不均匀性，仅顶端分生组织的1～2片叶原基即0.1～0.2mm不带毒[7]，因此，只有保证所切茎尖在0.2mm以内，才可能成功脱除病毒，大则影响脱毒率，小则影响成活率[5，8]，这对操作者的操作水平要求极高。受传统茎尖嫁接脱毒的条件限制，迫切需要寻找一种高效、简便、稳定的脱毒代替技术。

近年来研究发现，经超低温冷冻保存的植物种质种植成活后，植株往往不带病毒，这一现象渐渐受到脱毒研究人员的关注[9]。玻璃化法是超低温保存方法中的一种[10-13]，玻璃化法-超低温处理脱毒是以超低温保存为基础的一种高效、简便的脱毒技术，依据病毒在植物体内分布不均匀性的原理[7]，利用液氮提供的-196℃超低温环境对含有病毒的分化细胞进行破坏，而不含病毒或病毒含量少的顶端分生组织可以在一定条件下恢复生长，从而达到脱去植物病毒的目的[9]，该方法因其材料处理程序简单、不需要特殊仪器设备、方便处理大量样本材料[1，14，15]、病毒清除不受茎尖大小的限制[9，14，16-18]，清除病毒效果和重演性好[1，14-16，18-22]、具有广泛适用性[23，24]、且不改变材料本身的遗传性状等优点而备受人们推崇[4，22，25-28]。

本文对柑橘玻璃化法-超低温脱毒技术的原理、应用以及存在的问题和今后研究方向等方面进行简要概述，为从事柑橘脱毒领域的研究人员提供技术参考。

1 玻璃化法-超低温处理脱毒原理

植物茎尖分生组织经液氮超低温处理后能够存活，与其本身细胞的特性有关。茎尖分生组织由1、2片叶原基组成，这些细胞排列紧密，无成熟液泡组织，体积小，自由水含量低，细胞质浓稠，核质比较高，能够快速分裂和自我更新[9，16，29-32]，在超低温环境中，细胞质在保护剂作用下能形成玻璃化状态，因为自由水含量少，形成的微小冰晶对细胞的破坏力小，因此能经受住低温而存活下来；然而，已分化的成熟细胞含有大液泡，自由水含量较高，在超低温环境中能形成破坏细胞膜结构导致细胞死亡的树状冰晶[1，25，32-36]。所以经液氮超低温处理后，含有病毒的成熟细胞死亡，不含病毒的顶端分生组织存活下来，经过后续培养形成无病毒植株[1]。

柑橘茎尖玻璃化法-超低温脱毒技术流程：感染病毒的柑橘外植体培养长出嫩芽→切取茎尖→茎尖预培养→茎尖预处理→PVS2加载→液氮冷冻处理→卸载→恢复培养和植株再生→再生植株病原体检测。

2 玻璃化法-超低温脱毒技术的应用

1997年[37]Brison首次应用超低温脱毒法脱去李痘病毒（PPV），获得脱毒苗，该方法的病毒清除率达到50%，而茎尖嫁接仅有20%；后来，Helliot等[38]用玻璃化法-超低温保存法成功地从受病毒感染的香蕉中清除黄瓜花叶病毒（CMV）和香蕉条斑病毒（BSV），而且病毒清除率显著高于组织培养茎尖嫁接技术的脱毒率。Bi等[39]采用玻璃化法-超低温技术对葡萄卷叶病病毒（GLRaV-3）进行清除处理，冷冻处理后，芽的再生水平在43%到59%之间，而且恢复的所有植株都不含GLRaV-3病毒，该方法的脱毒效果和存活率均明显优于茎尖嫁接培养的脱毒。随着对玻璃化法-超低温冷冻技术的深入研究，已广泛应用于苹果[40，41]、葡萄[39]、香蕉[38]、马铃薯[9，16，42]、樱桃[37]等多种植物的病毒清除。

玻璃化法-超低温冷冻法在柑橘方面亦有研究[43-45]。王子成等[46]成功用玻璃化法-超低温技术保存柑橘茎尖，茎尖培养再生率有90%，再生后的苗能正常生根并移栽成活。Volk等[47]应用玻璃化法-超低温技术对8个柑橘茎尖进行保存，微嫁接后植株再生率平均达到53%；之后，Volk等[23]同样采用超低温技术对代表32个分类群的150份柑橘材料进行茎尖保存，供试的24个分类群的平均再生水平至少为40%，36份脐橙品种平均再生率为64%。接着，Volk等[45]又对540份不同柑橘品种的茎尖进行超低温保存可行性测试，结果有354份材料的再生水平达到40%或者更高水平，达到所设定的再生标准；再生率在10%～30%之间的材料有47份；其中有50个材料没有再生出芽，这项大规模的研究表明，大部分品种的柑橘材料经玻璃化法-超低温处理后可再生。说明柑橘茎尖经玻璃化法-超低温技术保存后可再生成完整植株。

Ding等[48]利用玻璃化法-超低温保存法成功从五种不同基因型的柑橘试管苗中清除黄龙病病菌，经再生培养后获得无黄龙病病菌的植株，该方法的病菌清除率高达98.1%，茎尖存活率也在76%以上，显著高于传统的茎尖嫁接脱毒。还有研究表明，即使采用较大的柑橘茎尖(2～2.5mm)，也能达到88.2%及以上病毒清除率[49]。因此，玻璃化法-超低温处理在柑橘脱毒方面具有很好的应用前景，可作为一种新型脱毒技术替代传统的茎尖嫁接脱毒。

3 柑橘茎尖玻璃化法-超低温脱毒的影响因素

3.1 品种类型

茎尖玻璃化法-超低温处理后的再生率因品种类型不同差异很大。Ding等[48]研究得出，不同品种类型的柑橘离体茎尖经超低温处理后具有不同的存活率，从76%到83.4%不等，但所有材料的所有品种类型的黄龙病病原体清除率基本相同，在90.9%～94.3%之间。王子成等[46]研究发现，所试的四个品种中，枳壳是柑橘类植物中最抗寒的类型，经超低温处理后，其再生率最高。从Volk等[45]对540份不同柑橘品种茎尖进行超低温保存的测试实验结果中也能说明，不同柑橘品种的茎尖经超低温处理后再生水平存在差异。不同品种之间超低温处理后存活率不同，可能与品种抗寒性有关[14，46，50，51]，这就需要科研工作者根据柑橘品种类型的不同相应的调整低温处理程序以提高其再生率。

3.2 茎尖大小

茎尖大小对玻璃化法-超低温法的病毒清除率影响不大[9，14，16，18]，但处理后茎尖的成活率对大小有一定的要求[9，52]。所切茎尖体积过大，不利于细胞脱水；体积太小，受冷冻保护剂的毒害较大，均影响成活率。Ding等[48]在玻璃化法-超低温脱除柑橘黄龙病菌的研究中发现，当茎尖长度在1.0～1.5mm时，超低温处理后的存活率较高，约为85.2%，较短或较长的茎尖存活率均较低，但不论茎尖大小如何，再生植株中黄龙病病菌的清除率均相似。

3.3 预培养

为了提高柑橘茎尖经低温处理后的成活率，需要对茎尖进行预培养[53]。在预培养基里加入蔗糖、甘油等保护剂物质，可减少植物细胞内的自由水含量，增强茎尖对低温的耐受性[54，55]。Volk 等[23，56]采用将柑橘茎尖放在含有0.3M蔗糖的MS液体培养基中在黑暗条件下培养过夜的方法对柑橘茎尖进行预处理；Ding等[48]在玻璃化法-超低温脱除柑橘黄龙病实验中使用的预处理方法是将茎尖在0.3mol/L蔗糖+0.4mol/L甘油的MT培养基中培养3d。两个实验均获得较好的茎尖成活率，预处理方法和时间的不同，可能与基因型以及后续的PVS2处理时间不同有关[28，57]。

3.4 PVS2加载

PVS2是一种较好得冷冻保护剂，即玻璃化剂[12]。PVS2加载可脱去细胞中的自由水，并使玻璃化剂渗入细胞，使细胞达到玻璃化，减轻在超低温处理过程中细胞所受到的伤害，用以提高超低温处理后茎尖的成活率[12，34]。研究发现，因为 PVS2对植物材料的毒害作用[54，58]，在室温下用 PVS2加载，材料容易死去，故在0℃条件下对材料进行加载，可降低 PVS2对材料的毒害程度[46，59]。

PVS2加载时间对柑橘低温处理后的成活率影响很大，加载时间短则细胞脱水不足，在降温过程中不能形成玻璃化状态；加载时间过长，则茎尖因PVS2的毒害作用而成活率降低。王子成等[46]用玻璃化法对四种柑橘品种的茎尖进行超低温保存，用PVS2处理60min时，成活率均达到最高，其中枳壳耐受性较强，时间延长至80min仍有88.67%的成活率；之后，王子成等[60]用改良的玻璃化法对柑橘品种飞龙枳和印度酸橙茎尖进行超低温保存，作不同时间PVS2处理，得出与之前相同的结果；而Volk等[47]在对多种柑橘品种进行玻璃化法-超低温保存的研究中得出，PVS2加载时间30min或者60min均可获得较高的再生水平。不同柑橘品种PVS2加载时间存在差异，可能是由于不同柑橘品种对PVS2耐受力的不同造成。

3.5 液氮冷冻

将茎尖包裹在PVS2小液滴中，放在锡箔纸上，直接投入液氮中冷冻处理[44]。因病原体的根除与低温程序无关[14，17，20，21]，所以液氮冷冻时间对病毒清除率影响不大[23]。Volk等[44]采用玻璃化法-超低温保存技术对葡萄柚、柠檬、酸橙三个柑橘品种的茎尖低温保存5年，用以检测冷冻时间对茎尖再生水平的影响，期间每年取样测试，得出冷冻时间的长短对茎尖再生水平影响不大。

3.6 卸载

卸载过程包括液氮处理后茎尖的解冻和洗涤，也是超低温处理过程中影响成活率的重要环节[13]。将液氮处理下的茎尖快速放入22℃的卸载液中进行解冻[45]，迅速通过冰晶温区(-60℃～-40℃)，可避免因缓慢升温造成细胞内再次结冰现象，这对保持细胞活性至关重要[25]。

液氮冷冻后的茎尖，因细胞内含有PVS2，不能直接进行培养，需要用卸载液对茎尖进行洗涤[61]，最常用方法是用含1.2 M蔗糖的1/2 MS液体培养基在室温条件下洗涤2次[23，47，56]，如替换成无菌水洗涤，则茎尖的再生率低于用蔗糖洗涤[46]。

3.7 再生培养

卸载后的茎尖，需要放入培养基中进行恢复培养一段时间。而恢复培养基的成分，也会影响低温处理后的再生率。Wang等[62]研究得出，将玻璃化法-超低温处理后的茎尖在含有BA的恢复培养基中培养一段时间可显著提高存活率。还有研究发现，将恢复培养的茎尖放在黑暗条件下培养18h，再嫁接到砧木上，有利于茎尖再生的形成[47，63～65]。若将茎尖直接放在培养基上培养，其无法生长成完整植物，这很可能是因为培养基不能满足茎尖的生长要求，所以使用嫁接法进行后续的再生培养[65]。

3.8 病毒检测

对再生的柑橘植株运用荧光定量PCR检测法、常规PCR检测和指示植物鉴定法进行病毒检测，只有不带病毒的植株才可以作为无病毒母本树进行繁育生产[66]。

4 展望

玻璃化法-超低温脱毒技术为柑橘脱毒开辟了一条崭新的途径，已发展成一项新的生物技术，相比于传统脱毒技术更有效率和优势，具有代替传统茎尖嫁接脱毒技术的潜力[1，15，67]。作为一个新兴领域，尽管低温脱毒技术有着广阔前景，但仍面临着许多挑战。首先，柑橘的玻璃化法-超低温脱毒技术体系仍不健全，低温处理后茎尖的存活率仍是限制玻璃化法-超低温脱毒技术成功的最大问题。因此，仍需在柑橘品种类型、茎尖预培养、PVS2加载等方面开展深入研究，以建立起一套稳定高效的病毒脱毒体系；其次，用超低温成功根除的病原物的研究仅限于少数病原类型，对于一些能感染分生组织细胞的病毒，尚未见报道，仍需进一步探索研究；再者，目前对玻璃化法-超低温根除柑橘病原物的研究远远少于传统的茎尖组织培养和热处理脱毒[68]，以现在对其的研究水平，还不能完全替代传统的脱毒技术，仍需科研工作者在玻璃化法-超低温脱毒技术的研究中投入更多的时间和精力。