pH依赖型脂肪酸辅助的分散液-液微萃取与高效液相色谱仪联用测定水样中3种多环芳烃

孙孟华，金 倩，陈庆芝，李晓敬，赵 烨，赵 阳

(河北省地质实验测试中心，河北 保定 071051)

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指两个或两个以上苯环以线状、角状或簇状排列的稠环碳氢化合物[1]。PAHs是最早被发现具有致癌作用的物质，并且具有致畸性和致突变性[2]。随着工业的发展，煤和石油等消耗急剧上升，PAHs作为有机材料不完全燃烧或者热解的产物广泛存在于环境中[3-4]。近年来绿色样品前处理方法的研究主要集中于减少有机溶剂用量、缩短萃取时间和节约成本，并相继出现了各种各样的萃取方法[5-6]，如固相微萃取(SMPE)[7]、液-液微萃取(LLE)、单滴微萃取(SDME)、中空纤维液相微萃取(HF-LPME)[8]和分散液-液微萃取(DLLME)[9-11]等。其中分散液-液微萃取(DLLME)由于其简单、快速、富集效果好的特点得到了分析工作者的青睐。新型的分散溶剂(如离子液体、中链饱和脂肪酸、表面活性剂等)常用来代替传统的DLLME中经常使用的分散溶剂[12]。DLLME中常用的轻质萃取剂(如烷烃类、脂肪醇类等)在与水的混合液离心后可漂浮于水相上方，但其聚集状态的不完整导致了与水相分离的困难。解决这一问题可采用较细尖端的容器如塑料吸管、注射器等将萃取剂聚于容器顶端以利于其收集。Tehrani 等[13]利用表面活性剂辅助的分散液-液微萃取法萃取尿液中的苯丙胺，缩短了萃取时间；付博等[9]利用漂浮液滴固化分散液-液微萃取与高效液相色谱联用检测环境水样中的3 种烷基苯酚，使用冷冻固化萃取剂的方式使之与水相分离，从而达到回收分析物的目的；Shih等[14]将1-辛醇作为分散液-液微萃取方法的萃取剂，通过酸碱作为 pH 调节剂，与磁性固相微萃取技术相结合对环境水样中的烷基苯酚进行了分离和萃取。这些利用表面活性剂、漂浮液滴固化以及与磁性固相微萃取技术相结合的分散液-液微萃取方法操作简单、绿色环保，可达到预期效果。

目前检测 PAHs 的方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[15-16]、高效液相色谱紫外/荧光检测法(HPLC UV/FLD)[17]等。但GC-MS法对于热稳定性较差的多环芳烃的检测效果较差，且脂类物质易在气相色谱系统的进样口、毛细管柱及质谱的离子源处积聚，增加了基线噪声，影响了仪器的分析性能[15]。气相色谱-质谱法同时依靠保留时间和碎片离子进行定性，结果更为可靠，但其灵敏度不如液相色谱法高，难以满足痕量PAHs 的测定[16]。为了弥补这种不足，本研究选择高效液相色谱法分析水样中的多环芳烃。在已有研究基础上，本文以脂肪酸(正庚酸)作为新型DLLME萃取剂，利用浓氨水和浓硫酸调节溶液pH值，建立了pH依赖型脂肪酸辅助的分散液-液微萃取方法，并与高效液相色谱联用检测了环境水样中的3种多环芳烃，验证了正庚酸作为DLLME萃取剂的适用性，为水样中菲、芘和苊的检测提供了环境友好的新前处理方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

菲、芘、苊购于美国Sigma-Aldrich公司；正庚酸(天津市光复精细化工研究所)；28%浓氨水、98%浓硫酸、乙腈(色谱纯)均购自天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇(天津市康科德科技有限公司)；实验用水均为去离子水(电导率≥18 MΩ·cm)，所用试剂若未说明均为分析纯，且使用前无需进一步纯化。用乙腈配制5 μg/mL菲、芘和苊混合标准储备液，于 4 ℃密封保存，使用时用水稀释至所需的浓度。

LC-20AD型高效液相色谱仪，SPD-20A紫外可见分光光度检测器(日本岛津公司)；LG10-2.4A高速离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)；KQ5200E超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MS204S型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)。

1.2 高效液相色谱检测条件

色谱柱：Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃。流动相：乙腈-水(53∶47,体积比)，临用前过0.2 μm微孔滤膜，流速为1 mL/min，进样体积为20 μL，采用双波长模式检测，检测波长分别为λ=265 nm、λ=290 nm。

1.3 萃取原理

脂肪酸是一种在溶液中通过改变pH易离子化的化合物，并且可以产生具有表面活性剂性能(在油和水相中可以产生胶束)的亲水基团。将萃取剂正庚酸加入样品溶液中，由于其与水相不互溶而悬浮在溶液表面。当加入28%浓氨水将溶液调至碱性时，大约99.9%的脂肪酸呈离子状态形成胶束，疏水性的多环芳烃被萃取至胶束中。当加入98%浓硫酸将溶液调至酸性时(约比正庚酸的pKa值小3)，超过99.9%的脂肪酸会返至最初的疏水状态，从而带着目标萃取物与水相分离(原理如图1所示)。本文通过调节溶液的pH值以改变正庚酸的存在状态，从而完成对水相中多环芳烃的萃取，并通过与HPLC联用检测了自来水、井水和海水样品中的菲、芘和苊。

图1 pH依赖型脂肪酸辅助的分散液-液微萃取的反应机理Fig.1 Mechanisms of molecule interactions in pH-dependent fatty acid-assisted dispersion liquid-liquid microextraction

图2 pH依赖型脂肪酸辅助的分散液-液微萃取过程示意图Fig.2 Schematic diagram of pH-dependent fatty acid-assisted dispersion liquid-liquid microextraction

1.4 脂肪酸辅助的分散液-液微萃取过程

脂肪酸辅助的分散液-液微萃取过程如图2所示，准确量取5 mL水样置于玻璃试管中，加入一定量的多环芳烃混合标准溶液，55 μL正庚酸，摇匀。再向水样中加入50 μL 28%浓氨水，手摇使其混合均匀，此时溶液变清澈。振摇30 s后加入500 μL 98%浓硫酸，此时溶液呈乳浊液状态。将试管置于离心机中，3 500 r/min离心3 min后，用针管取出上层正庚酸，取5 μL注入HPLC进行分析。

2 结果与讨论

2.1 萃取剂种类的选择

DLLME 方法要求其萃取剂的熔点接近室温(10～30 ℃)，且密度小于水。本实验中，作为pH依赖型萃取溶剂的中等长度饱和脂肪酸的选择对萃取效率起着至关重要的作用，脂肪酸中烷基链的碳数影响其两亲特征。因此，考察了3种不同饱和脂肪酸(正己酸、正庚酸和正辛酸)作为萃取溶剂对多环芳烃的萃取性能。在5 mL加标1 μg/L的水样中分别加入55 μL饱和脂肪酸，50 μL 28%浓氨水，手摇使溶液均匀，再加入500 μL 98%浓硫酸得到浑浊溶液，离心使饱和脂肪酸与水相分离。结果显示，由于正己酸在室温下具有高的水溶性，在脂肪酸辅助的分散液-液微萃取中不能与水相分离，只有正庚酸和正辛酸可以作为萃取剂完成后续研究。进一步研究这两种脂肪酸的萃取性能(图3)，结果表明，正庚酸的萃取效率较高，且其作为萃取剂时获得的色谱图中杂质干扰较少。因此，在后续研究中，选择正庚酸作为萃取溶剂。

2.2 萃取剂用量的优化

在脂肪酸辅助的分散液-液微萃取中，萃取剂用量也是影响萃取效率的一个重要因素。当正庚酸的体积小于20 μL时不能顺利地从玻璃管中取出，导致实验的可操作性降低，正庚酸的回收体积低，影响了萃取效率，因此考察了萃取剂(正庚酸)用量对萃取效率的影响。将30～70 μL正庚酸分别加至5 mL水样(含有1 μg/L的菲、芘和苊)，再向水样中加入50 μL 28%浓氨水，手摇使其混合均匀，最后加入500 μL 98%浓硫酸，得到一种浑浊溶液，离心使饱和脂肪酸与水相分离。结果表明，随着萃取剂体积的增加，3种目标分析物的萃取回收率逐渐提高。当正庚酸的体积高于55 μL时，3种目标物的萃取回收率均趋于稳定，但富集倍数随正庚酸体积的增大而下降，为了保证具有较高的回收率和较大的富集倍数，实验选择正庚酸的用量为55 μL。

2.3 28%浓氨水用量的优化

当溶液pH值比脂肪酸在水中的平衡解离常数的负对数(pKa)大3以上时，大部分脂肪酸可被转换为其阴离子形式，从而溶于水形成表面活性剂胶束。在脂肪酸辅助的分散液-液微萃取中，28%浓氨水的用量会影响正庚酸的转化，其用量越大，正庚酸转化为表面活性剂的量越多。然而，加入过多28%浓氨水时，则需要更多量的98%浓硫酸中和以将铵化的表面活性剂转化为正庚酸。考察了不同氨水用量对3种多环芳烃萃取回收率的影响，将55 μL正庚酸加至5 mL水样(含有1 μg/L的菲、芘和苊)，再向水样中分别加入30～70 μL 28%的浓氨水，手摇使其混合均匀后，加入500 μL 98%的浓硫酸，得到一种浑浊溶液，离心使饱和脂肪酸与水相分离。实验结果显示，当加入50 μL 28%的浓氨水时，正庚酸对水样中多环芳烃的萃取效率达到最高，继续增大浓氨水的体积，其萃取效率几乎无明显变化。因此，实验选择加入50 μL 28%浓氨水调节溶液pH值。

2.4 98%浓硫酸用量的优化

由于浓硫酸的用量会影响表面活性剂转化为疏水性脂肪酸的量，从而影响方法的萃取效率。为了优化其用量，考察了加入300～700 μL 98%浓硫酸对3种多环芳烃回收率的影响。将55 μL的正庚酸分别加至5 mL水样中(含有1 μg/L的菲、芘和苊)，再向水样中加入50 μL 28%浓氨水，手摇使其混合均匀后，加入300～700 μL 98%浓硫酸，得到一种浑浊溶液，离心使饱和脂肪酸与水相分离。实验结果显示，当98%浓硫酸的用量从300 μL增至500 μL时，多环芳烃的萃取效率显著提高，这是因为随着浓硫酸用量的增加，会形成更多中性介质的正庚酸，有利于萃取效率的提高。当98%浓硫酸用量大于500 μL时，萃取效率趋于稳定。经验证，当加入500 μL 98%浓硫酸时，溶液的pH大约为0.52，远远低于正庚酸的pKa。因此，选择500 μL作为98%浓硫酸的最佳用量。

2.5 离心时间的优化

在脂肪酸辅助的分散液-液微萃取中，需要通过离心使正庚酸与水相分离，从而实现对多环芳烃的萃取，为此考察了离心时间的影响。将55 μL正庚酸分别加至5 mL水样(含有1 μg/L的菲、芘和苊)，再向水样中加入50 μL 28%浓氨水，手摇使其混合均匀后，加入500 μL 98%浓硫酸，得到一种浑浊溶液，分别离心1～5 min使饱和脂肪酸与水相分离。结果显示，当离心时间过短时，正庚酸尚未与水相完全分离，从而使获得的正庚酸体积少，萃取率低。随着离心时间的延长，相分离逐渐完全，得到的正庚酸相应增多，回收率逐渐提高，当离心时间为3 min时，回收率达到最高，继续延长离心时间，回收率无明显提高。因此，本实验选择3 min作为最佳离心时间。

2.6 盐效应

向10 mL 水样中加入0～10 g NaCl，以考察盐浓度对3 种多环芳烃萃取效率的影响，结果发现盐浓度对分析物的富集倍数几乎无影响。本实验的3 种目标分析物均为多环芳烃，加入NaCl可能对分析物具有盐析效应，使更多的分析物溶解于有机相之中。但加盐后收集到的萃取剂体积明显大于不加盐时所收集到的萃取剂体积，产生了稀释效应，推测稀释效应与盐析效应相抵消导致盐浓度对萃取效率几乎无影响。为了提高实验的可操作性，选择加入0.5 g NaCl，以保证萃取后可以回收到足够体积的萃取剂，便于下一步的进样分析。

2.7 测定波长的选择

选择合适的测定波长对于样品的检测至关重要，应该以杂峰少，且分离效果好，被测元素的吸收波长处无杂峰干扰为原则。经实验测定，最终确定采用双波长测定方法，其中菲和苊的检测波长为290 nm，芘的检测波长为265 nm。

2.8 方法的可靠性验证

2.8.1 线性范围与检出限为了验证方法的可靠性，分别在水样中加入5种不同质量浓度的多环芳烃混合标准溶液，在最优条件下萃取目标分析物并用高效液相色谱仪进行定性和定量分析。每种浓度平行做3次，由低浓度向高浓度进样，计算各质量浓度水平上的峰面积，并对其进行线性拟合。结果显示，菲、芘和苊在20～500 μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数均不小于0.999 3。以3倍信噪比(S/N=3)为基准，将标准溶液逐级稀释，得出菲、芘和苊的检出限分别为13.11、10.48、9.18 μg/L(见表1)。

表1 菲、芘和苊的线性范围、线性方程、相关系数及检出限Table 1 Linear ranges，regression equations,correlation coefficients(r2)and LODs of phenanthrene,pyrene and acenaphthene

y：peak area；x：mass concentration(μg/L)

2.8.2 精密度与重现性在最优实验条件下萃取水中的多环芳烃，连续制备样品6次，用所建立的方法对其保留时间及峰面积求相对标准偏差(RSD)。结果显示，3种分析物保留时间及峰面积的RSD 均不大于3.3%，证明方法有良好的日内精密度。用本方法对连续6天制备相同浓度水平的样品进行日间重现性测定，计算保留时间和峰面积的RSD。结果显示，3种分析物保留时间及峰面积的RSD 均不大于4.2%，表明方法具有良好的日间精密度。

2.8.3 实际样品分析与回收率测定为验证方法的可行性，将自来水(采自本实验室)、井水(采自保定市蠡县)和海水(采自渤海)作为实际样品，经0.45 μm微孔膜过滤后，在最佳萃取条件下测定3种实际水样中的菲、芘、苊残留。结果显示3种水样中均未检出目标分析物。

为了考察基体效应，向自来水、井水和海水样品中分别加入3种质量浓度水平(0.5、5、50 μg/L)的多环芳烃混合标准溶液进行加标回收实验，用所建立的方法进行样品预处理和分析检测，每种浓度平行做3次，计算其加标回收率和相对标准偏差。测定结果如表2所示，菲、芘、苊的回收率分别为87.9%～110%、98.9%～110%、88.9%～108%，RSD均不大于3.0%，表明此方法可用于实际水样菲、芘、苊的检测。图4为海水及海水加标样品的色谱图。

表2 多环芳烃在自来水、井水及海水中3种加标水平下的回收率及相对标准偏差(n=3)Table 2 Recoveries and RSDs of PAHs from tap water,well water and sea water at three spiked levels(n=3)

3 结 论

本文通过对萃取剂种类、萃取剂用量、28%浓氨水用量、98%浓硫酸用量以及离心时间等条件的探索，建立了一种水样中PAHs检测的新方法。与已报道的前处理方法相比，本方法选用正庚酸作为萃取溶剂，通过调节溶液的pH值实现水样中PAHs的萃取。实验过程无需任何特殊装置即可对萃取剂进行收集，整个萃取过程仅需6 min，提高了萃取效率，节省了时间；采用高效液相色谱仪作为检测手段，提高了方法的灵敏度和再现性，获得了可靠的分析结果，方法有望拓展于其他化合物的萃取及测定。