超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法定性分析奥利司他氢化液中的杂质

王 军，李铁健，曲喜龙，吴桂梅，张贵民*

(1.鲁南制药集团股份有限公司，山东 临沂 276005；2.山东新时代药业有限公司 国家手性制药工程技术研究中心，山东 临沂 273400)

奥利司他是全球唯一的非处方类减肥药，目前有超过四千万人使用并成功减肥[1]。该药由瑞士Hoffmann-La Roche公司研发，1998年在新西兰首次上市，1999年获准在欧美国家上市，2001年获准在中国上市。奥利司他为胃肠道脂肪酶抑制剂[2]，通过减少脂肪吸收而达到减肥目的。

图1 氢化反应过程Fig.1 Reaction formula of hydrogenation

奥利司他的疗效得到了一致认可[2-5]，但有一些不良反应逐渐被报道[6]，从而促进对该药物杂质的研究更加深入。目前对奥利司他的杂质研究主要在制剂方面，分析方法包括高效液相色谱(HPLC)法[7-10]、高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法[1，11-12]，在原料检测与生物代谢方面亦有研究[13-15]，但对奥利司他氢化液的杂质研究尚未见报道。奥利司他氢化液由利普司他汀发酵液氢化而得，其反应过程见图1。本文首次对奥利司他氢化液的杂质进行研究，利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)对其中的杂质进行了定性分析，可为下一步工艺纯化与质量研究提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色谱仪、6540B四极杆-飞行时间质谱仪(美国Agilent公司)，配有电喷雾离子源(ESI)以及MassHunter B.06.00数据处理系统。

奥利司他氢化液(山东新时代药业有限公司，批号：19020100)；乙腈(色谱纯，Merck公司)；乙酸(色谱纯，Fluka公司)；实验用水为自制超纯水。

1.2 色谱与质谱条件

色谱条件：色谱柱为Thermo Hypersil gold aq C18柱(2.1 mm×150 mm，1.9 μm)；流动相为0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈(25∶75)；柱温为40 ℃；流速为0.3 mL/min；进样量为5 μL。

质谱条件：ESI源，正离子模式；扫描范围m/z50～600；雾化气温度为300 ℃；毛细管电压为4 kV，干燥气流速为10 L/min；裂解电压为60 V；锥孔电压为45 V。

1.3 溶液配制

取奥利司他氢化液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用流动相稀释定容，取适量过0.22 μm滤膜，滤液作为供试品溶液。

1.4 实验过程

将“1.3”的供试品溶液进样，按照“1.2”条件进行分析，获得各成分的精确分子量与二级质谱碎片信息。

2 结果与讨论

2.1 UPLC-Q-TOF-MS方法的优化

美国药典中检测奥利司他原料药的HPLC流动相为磷酸水与乙腈[16]，但由于磷酸难挥发，故无法直接进入质谱进行样品分析，而乙酸可在质谱离子源内挥发，因此本实验分别向水与乙腈中添加0.1%乙酸作为流动相。进一步优化洗脱比例后发现，当0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈的比例为25∶75时，总离子流图(TIC)中各杂质在35 min内可有效分离，且具有较好的质谱响应，有利于下一步杂质的定性分析。

目前UPLC-MS仪常用的离子源主要包括ESI源与大气压化学电离源(APCI)两种类型。ESI源的原理为液滴在运行中，溶剂不断快速蒸发，液滴逐渐变小，表面电荷密度不断增大，当电荷排斥的静电力超过液滴表面张力，即引起库仑爆炸，使带电液滴排出溶剂和样品离子；APCI源的原理为样品溶液在电晕针作用下先带电，再将电荷转移给化合物形成离子[17]。因此ESI源适合分析极性与中等极性的样品，而APCI源适合分析弱极性的样品。结合上述离子源性质与奥利司他结构特点，并参考文献报道[1,11]，本研究最终采用ESI源，在正离子模式下进行样品分析。

奥利司他的分子量小于500 Da，由于其杂质结构与奥利司他结构相似，因此最终选定质谱采集范围为m/z50～600。获得杂质的一级质谱图后，分别对各母离子优化碰撞能量，在碰撞池内进行碰撞诱导解离(CID)，最终获得各杂质的二级质谱碎片离子，并据此对各杂质的可能结构进行推导。

图2 供试品溶液的TIC图Fig.2 TIC spectrum of sample solution

图3 奥利司他的二级质谱图Fig.3 MS/MS spectrum of orlistat

2.2 供试品溶液的总离子流图

供试品溶液的TIC见图2，对其中较大的杂质依次编号1～16。采集TIC图时，将2.5 min前的蛋白类与无机盐类杂质切入废液管路，可有效防止污染质谱。杂质6与杂质7虽未能实现基线分离，但在质谱中不影响杂质的定性分析。

2.3 奥利司他的质谱信息

主成分奥利司他的二级质谱图见图3，母离子峰m/z496.400 8为[M+H]+峰。其裂解途径如图4所示：奥利司他在质谱中由C—O键断裂，碎裂为Ⅰ与Ⅱ部分。其中Ⅰ部分通过ⅰ途径裂解，生成碎片离子m/z160.096 8，该离子通过脱水生成m/z142.086 3，再脱去羰基，生成碎片离子m/z114.091 5。Ⅱ部分通过ⅱ途径裂解成碎片离子m/z337.311 3，该离子可通过脱去C10H21基团后继续脱氢生成m/z193.195 4；碎片离子m/z337.311 3还可脱水生成m/z319.300 6，再进一步脱水生成m/z301.289 7，这与文献报道的断裂机理基本一致[1]。Ⅰ与Ⅱ部分的特征碎片离子对杂质结构解析具有重要意义。

图4 奥利司他的裂解途径Fig.4 Fragmentation pathway of orlistat

2.4 杂质结构解析

2.4.1 杂质的质谱信息经UPLC-Q-TOF-MS分析后，获得16个杂质的精确分子量与二级质谱碎片，具体质谱信息见表1。通过精确分子量，利用MassHunter软件计算出分子式，各精确分子量与理论值的误差均小于1×10-5；根据二级质谱碎片可对杂质结构进行解析。

表1 奥利司他氢化液中杂质的质谱信息Table 1 MS information of impurities in orlistat hydrogenation solution

(续表1)

No.Parent ion(m/z)Molecular formulaCollision energy(eV)Fragment ions(m/z)Chemical structure9468.369 1[M+H]+C27H49NO58309.279 1,291.268 7,273.256 9,193.195 2,160.096 6,142.086 1,114.091 410513.426 9[M+NH4]+C29H53NO510496.400 2,337.310 6,319.300 1,193.195 2,160.096 7,142.086 2,114.091 311482.385 1[M+H]+C28H51NO59337.311 1,319.300 2,301.289 5,193.195 1,146.081 1,128.070 7,100.076 112530.384 1[M+H]+C32H51NO512337.310 1,319.300 1,301.288 6,211.205 4,194.081 2,193.195 1,176.070 3,166.085 9,148.075 413513.426 1[M+NH4]+C29H53NO510496.400 5,337.310 6,319.300 3,193.195 2,160.096 8,142.086 2,114.091 4Isomeric with impurity 1014510.415 7[M+H]+C30H55NO510351.326 1,333.315 7,193.194 9,160.096 7,142.088 3,114.091 315524.430 6[M+H]+C31H57NO512365.341 9,347.331 1,193.195 3,160.096 7,142.086 2,114.091 316524.431 6[M+H]+C31H57NO512365.342 1,347.331 5,193.195 1,160.096 9,142.086 4,114.091 5Isomeric with impurity 15

2.4.2 杂质结构推导结合表1中的杂质信息对其结构推导如下。

杂质1的母离子m/z542.404 9为[M+H]+峰，杂质2的母离子m/z542.406 1为[M+H]+峰，经软件计算分子式均为C30H55NO7，二者互为同分异构体，均比奥利司他多1个CH2与2个O原子。由于杂质1的Ⅰ部分特征碎片离子均保留，说明该部分的裂解机理与奥利司他ⅰ途径一致；Ⅱ部分通过ⅱ途径生成碎片离子m/z383.316 5后，该离子脱去C10H21O2基团后脱氢生成m/z207.174 1，继续脱水生成m/z189.168 5；碎片离子m/z383.316 5还可脱水生成m/z365.305 5，继续脱甲基后生成m/z351.290 2，进一步脱水生成m/z333.279 3。由于Ⅱ部分的特征碎片离子m/z337.311 3消失，m/z383.316 5存在，因而可判定在Ⅱ部分上引入了1个CH2与2个O原子；而且Ⅱ部分的特征碎片离子m/z193.195 4消失，m/z207.174 1仍存在，因此可判断在C6H13基团上引入了1个CH2，即成为C7H15；而2个O原子则可能连接在C11H23链上；2个O原子的位置不同导致了2个异构体的产生。另外，杂质1还可通过途径ⅲ发生脱水反应生成碎片m/z524.395 1。其具体断裂途径如图5所示。通过杂质2的碎片离子可知，杂质2的裂解途径与杂质1一致。

图5 杂质1的可能裂解途径Fig.5 Fragmentation pathway of impurity 1

杂质3的母离子m/z512.395 4为[M+H]+峰，杂质7的母离子m/z512.396 9为[M+H]+峰，经软件计算分子式均为C29H53NO6，二者互为同分异构体。由于杂质3中存在碎片离子峰m/z494.384 6，说明发生了脱水反应，结合分子式可判断这两个杂质比奥利司他多1个OH。由于Ⅰ部分的特征碎片离子保留，说明该部分的裂解机理与奥利司他的ⅰ途径一致；Ⅱ部分通过ⅱ途径生成碎片离子m/z353.306 1后，该离子脱去C10H21基团后脱氢生成碎片m/z209.189 9，再失去1分子水，生成m/z191.179 5；碎片离子m/z353.306 1还可脱水生成m/z335.295 2，进一步脱水生成m/z317.284 4。由于Ⅱ部分的特征碎片离子m/z193.195 4消失，且存在m/z209.189 9碎片，可以判定在C6H13上引入了OH；由于OH位置不同形成了2个异构体。另外，杂质3还可通过途径ⅲ发生脱水反应，生成碎片离子m/z494.384 6。杂质3的可能裂解途径如图6，通过杂质7的碎片可知，其裂解途径与杂质3一致。

其余杂质的裂解机理与上述杂质裂解机理类似。最终杂质结构汇总见表1。

2.5 讨 论

2.5.1 杂质来源推测本工艺为毒三素链霉菌发酵过程中生物合成利普司他汀，再将利普司他汀还原获得奥利司他。利普司他汀的生物合成机理[18]如图7所示：化合物1(3-羟基十四烷-5,8-二烯酰基-辅酶A)与化合物2(辛酰-辅酶A)通过Claisen缩合反应合成利普司他汀的碳骨架化合物 3，化合物3上的酮基被进一步还原为羟基后生成化合物4，进而缩合为β-内酯环生成化合物5，化合物5再结合L-亮氨酸，最后形成化合物6(利普司他汀)。

上述化合物1由发酵物料油脂中的亚油酸与辅酶A反应生成，而化合物2由油脂中的辛酸与辅酶A反应生成[18]。结合图7生物合成反应与各个杂质结构，对杂质来源推测如下：杂质4为亚油酸在生物合成过程中被氧化产生；其它含酮基或羟基的杂质(3、6、7)主要为辛酸被氧化产生的杂质；杂质10与13为奥利司他的异构体，判断为发酵过程中生成了利普司他汀的同分异构体，在下一步的还原加氢反应后，生成了奥利司他的同分异构体；杂质5为甲硫氨酸替代L-亮氨酸参与了生物合成过程，且硫原子被氧化后生成；而杂质11为缬氨酸替代L-亮氨酸参与生物合成过程生成；杂质12为苯丙氨酸替代L-亮氨酸参与发酵过程后形成；甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸均来源于发酵过程中的原料。其余杂质均为利普司他汀碳链引入或减少了(CH2)n所致，初步判断为亚油酸与辛酸的同系物参与了生物合成过程，从而带入到下一步的还原过程中。

图6 杂质3的可能裂解途径Fig.6 Fragmentation pathway of impurity 3

图7 利普司他汀的生物合成途径[18]Fig.7 Proposed mechanism of lipstatin biosynthesis[18]

2.5.2 分离与纯化奥利司他氢化液图谱经面积归一化后，该16个杂质的含量均占0.1%以上，最高值接近于1%。由于美国、欧盟的药品注册管理部门对药品纯度与杂质鉴定有严格要求，尤其是超过0.1%的未知单一杂质，要求提供分子结构或鉴定分析资料[19]，且杂质影响奥利司他的用药安全性[20]，因此必须对奥利司他进行纯化。目前奥利司他的分离纯化主要有两种方法：①在氢化反应前对利普司他汀进行纯化[21-22]，主要包括浸提、脱色、结晶、制备高效液相色谱等手段，再对纯化后的利普司他汀进行还原反应；②在氢化反应后对奥利司他进行纯化，主要包括层析[23]、结晶[24]、制备高效液相色谱[19]等方法。以上方法可将单一杂质含量控制在0.1%以下，达到奥利司他的质量要求。

3 结 论

本文采用UPLC-Q-TOF-MS法首次对奥利司他氢化液中的16个杂质进行了研究，根据质谱裂解规律推导了其结构，由于表1中部分杂质互为异构体，其二级质谱碎片基本一致，故无法对其进行准确定性，需使用核磁等其他手段进一步研究。对16个杂质的来源进行推测，发现主要由发酵过程引入。由于氢化液中杂质较多，且含量均在0.1%以上，因此需对氢化液进行分离纯化。本研究可为奥利司他的工艺优化与质量控制提供参考。