傅立叶变换离子回旋共振质谱法测定生物样品中的溶血磷脂酰胆碱

何凯丽,杨运云,徐 舸,向章敏*

(1.沈阳工业大学 理学院 化工系，辽宁 沈阳 110870；2.广东省测试分析研究所 广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东省原位电离质谱分析工程技术研究中心，广东 广州 510070)

溶血磷脂酰胆碱(LPCs)又称溶血卵磷脂,是一类脂质化合物。LPCs广泛存在于各种生物体内，是一类具有多种生理功能的生物活性信号分子，与动脉粥样硬化[1-2]、糖尿病[3]、心血管疾病[4]及癌症[5-7]等疾病密切相关。众多研究表明，生物体内LPCs的含量水平可作为疾病的潜在生物标志物[8-9]，在临床病理研究、疾病诊断及预防等方面发挥着重要作用。

生物样本中LPCs 的快速、准确测定是临床分析的一项重要任务。目前，LPCs的分析方法包括薄层色谱法(TLC)[10]、高效液相色谱法(HPLC)[11]、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[12-14]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[15-16]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[17]等。然而，这些技术均存在一定不足，如TLC在LPCs的检测中专属性较差，难以实现广泛应用。HPLC对复杂样品具有良好的分离能力，但检测灵敏度低，在目标物浓度较低时，基质干扰严重、选择性差、分析时间长，不适用于复杂生物样品中LPCs的痕量检测。GC-MS适用于挥发性和半挥发性物质的分析，LPCs的检测需要预先对样品进行酯化反应，样品前处理过程复杂，难以实现批量样品检测。因此，建立一种快速的LPCs分析检测方法十分必要。

傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)[18-22]技术具有灵敏度高、分辨率高、准确性好、分析速度快等特点，在化合物的精准检测方面有很大优势。利用FTICR-MS检测LPCs，可极大地缩短分析时间。此外，FTICR-MS具有超高的分辨率以及精确的质量准度，有利于待测物精确分子量的准确测定。本文建立了一种快速测定生物样品中4种LPCs(LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0)的FTICR-MS分析方法，该方法简便、快速、灵敏、准确，可满足生物样品中LPCs的检测要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR-MS SolariX XR7.0 T，德国Bruker公司)，BSA224S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；注射器(宣城市江南医疗器械有限公司)；JP-060S型超声波清洗机(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；TG16-W离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；数据处理软件(德国Bruker 公司，DataAnalysis 4.4)。LPCs标准品(LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0,美国Avanti Polar Lipids公司)；二氯甲烷、氯仿(分析纯，广州化学试剂厂)；LPCs标准品(25 mg);甲醇(色谱纯，美国Honeywell公司)。

样品：血浆与大鼠肝脏样品(8周龄雄性SD大鼠，体重180～220 g，ID：SYXK 2014-0137)于-80 ℃下保存，分析前于室温下解冻。

1.2 标准溶液的配制

分别称取LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0标准品各0.01 g(精确至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1 000 mg/L的混合标准储备溶液。准确移取适量混合标准储备溶液于容量瓶中，用甲醇逐级稀释成质量浓度为0.5、1、10、50、100 μg/L的混合标准工作溶液，待测。

1.3 样品前处理

1.3.1 人体血浆样品移取0.85 mL(精确至0.001 mL)样品于2 mL Eppendorf(EP)管中，加入1 mL甲醇-氯仿(9∶1，体积比)，涡旋萃取5 min，超声30 min,以12 000 r/min离心15 min,静置至室温，取上清液经0.22 μm滤膜过滤后，滤液待测。

1.3.2 大鼠肝脏组织样品将大鼠肝脏组织匀浆后，称取0.10 g(精确至0.000 1 g)样品于2 mL EP管中，加入1 mL甲醇-氯仿(9∶1，体积比)，涡旋萃取5 min，超声30 min，以12 000 r/min离心15 min，静置至室温，取上清液经0.22 μm滤膜过滤后，滤液待测。

1.4 质谱条件

采用FTICR-MS分析提取液中的LPCs。进样前，采用三氟乙酸钠进行质量准确度校正；采用250 μL微量进样器进样，流速为120 μL/h；ESI离子源；正离子模式检测；质量扫描范围m/z50～1 000；喷雾气压力(Nebulizer pressure):40 kPa；喷雾电压(Spray capillary voltage)：4.5 kV,毛细管出口电压：-500 V；射频电压：350 Vpp；雾化器(Nebulizer)：4×104Pa；干燥气体(Dry gas)为氦气，流速为4.0 L/min；干燥气温度(Drying gas temperature)：200 ℃；采集大小：2 M；累加次数：64 Scans；采集时间(Acquisition time)：0.200 s。每个样品注入ESI源前，需提前对离子源进行清理，直至背景信号强度小于105的响应，以确保样品的信号强度大于背景信号的3倍信噪比(S/N)。数据采集与分析均采用仪器配有的专用软件进行处理。

图1 不同提取溶剂对LPCs提取效率的影响Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction efficiencies of four LPCs

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的优化

由于生物样品成分复杂，待测化合物性质各异，本文分别考察了3种不同有机溶剂：甲醇、甲醇-二氯甲烷(9∶1，体积比)、甲醇-氯仿(9∶1，体积比)对样品的提取效果。以血浆样品为例，由图1可知，甲醇对4种LPCs的提取效率最低，甲醇-氯仿(9∶1)的提取效率最高，LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0的响应值均明显增大，且杂质干扰较小。为保证4种LPCs在生物样品中得到更好的提取，本文选择甲醇-氯仿(9∶1)为最佳提取溶剂。

图2 溶血磷脂酰胆碱(LPCs)的分子结构通式Fig.2 General formula of molecular structure of lysophosphatidylcholine(LPCs)

2.2 质谱条件的优化

2.2.1 检测模式的选择LPCs是一种带有正电荷的极性脂质，分子结构通式见图2。为确定质谱检测条件，本文首先对LPCs在质谱中的检测模式进行优化。选取50 μg/L LPCs混合标准溶液分别在电喷雾离子源的正离子和负离子模式下进行检测。结果显示，4种LPCs在正离子模式下的响应均高于在负离子模式下的响应，为保证检测灵敏度，本文选择在正离子模式下对LPCs进行检测。

2.2.2 定量离子的选择为进一步确定4种LPCs的定量离子，保证分析结果的准确性，本文分别在碰撞诱导解离电压为30 V的条件下对4种LPCs在混合标准溶液和血浆提取液中进行MS/MS分析，结果如图3所示。由该图可知，4种50 μg/L LPCs混合标准溶液(图3A)的主要二级质谱碎片为[M+Na-59]+,其主要是由于LPCs为一类含有N原子的化合物，其N原子上存在的孤电子对容易加合钠离子，因此得到待测物的基峰离子均为[M+Na]+。进行MS/MS分析时，在碰撞能量的诱导下脱去三甲基丙胺基(59 Da),从而得到了二级碎片离子[M+Na-59]+。此外，血浆提取液的MS/MS质谱图(图3B)中4种LPCs均能得到相应的二级碎片离子[M+Na-59]+，进一步证实了4种LPCs的定量离子为[M+Na]+。

2.2.3 质谱采集参数的优化在正离子检测模式下，对采集兆数(Size)、采集时间(Accumulative time)和采集次数(Scans)进行优化，以化合物的[M+Na]+峰为定量离子，优化后的定量离子、采集兆数、采集时间等质谱参数见表1。

表1 待测物质的质谱参数Table 1 MS parameters of tested components

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围、检出限与定量下限在优化条件下，采用FTICR-MS法对“1.2”配制的混合溶液进行测定，以LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0的质量浓度(x，μg/L)为横坐标，对应定量离子的质谱丰度(y)为纵坐标进行线性回归，结果见表2，由表2可知,LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0在0.5～100 μg/L质量浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数(r2)为0.993 0～0.998 3。采用基质样品加标方法，通过计算其样品加标的响应与背景噪音的比值分别确定检出限(LOD,S/N=3)和定量下限((LOQ,S/N=10)，得到4种LPCs的LOD为0.02～0.03 μg/L，LOQ为0.07～0.1 μg/L，日内精密度(Intra-RSD,n=6)为3.3%～4.3%，日间精密度(Inter-RSD,n=3d)为5.5%～9.3%，方法的灵敏度和准确性可满足复杂生物样品的检测要求。

表2 4种LPCs的线性方程、线性范围、相关系数(r2)、检出限、定量下限及相对标准偏差Table 2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients(r2 ),LODs,LOQs and RSDs of four LPCs

2.3.2 专属性将本方法用于20 μg/L LPCs混合标准溶液和血浆中4种LPCs的分析(见图4)。从图中可以看出，采用本方法进行测定时，无论是在低浓度标准溶液，还是在血浆样品提取液中，4种LPCs均有较好的响应。

2.3.3 回收率结果为验证该方法对不同生物样品的适用性，选取两种不同的生物样品(人类血浆、大鼠肝脏)分别加入3个不同浓度的LPCs混合标准溶液进行加标回收实验，所有实验均平行测定6次。由表3可知，4种LPCs在3个加标水平下的平均回收率为70.8%～95.0%，相对标准偏差(RSD)为1.2%～9.8%。以上结果表明该方法具有较高的准确度，且精密度和重现性良好。

表3 生物样品中4种LPCs混合标准溶液的回收率与相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of four LPCs mixed standards from biological samples(n=6)

2.4 实际样品的分析

采用本文建立的方法对5只健康大鼠(HR,蓝色片段)以及5只通过高脂饮食造模所得的患有脂肪肝的大鼠(FLR,棕色片段)对照组进行LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0检测。该方法中5组健康大鼠(HR)与脂肪肝大鼠(FLR)肝脏内4种LPCs的检测结果如表4所示。

表4 健康大鼠(HR)与脂肪肝大鼠(FLR)肝脏内4种LPCs的质谱丰度Table 4 MS spectra abundance of four LPCs in the livers of healthy rats(HR) and fatty liver rats(FLR) (×107)

由表4可知，健康大鼠(HR)与脂肪肝大鼠(FLR)肝脏内对应的4种LPCs中，均以LPC16∶0的丰度最高，其余依次为LPC18∶0>LPC13∶0>LPC15∶0。相对于健康大鼠(HR)，脂肪肝大鼠(FLR)肝脏内LPC16∶0的丰度无明显变化，但LPC13∶0、LPC15∶0和LPC18∶0的丰度降低较为明显，其中LPC13∶0的丰度减低近50%。为使结果更加清晰，采用热图对5组大鼠肝脏内4种LPCs含量进行进一步的对比分析，比较结果如图5所示。

图5 健康大鼠(HR)与脂肪肝大鼠(FLR)肝脏内4种LPCs含量的热图Fig.5 Heatmap of four LPCs contents in the livers of healthy rats(HR) and fatty liver rats(FLR)

由图5可知，热图在实际样品的分析中，能适用于多组别样品和目标物的综合分析，具有可视化比较4种LPCs相对浓度的优势，柱状图和行状图分别代表不同组别的大鼠和LPCs的相对含量。不同颜色显示出每只大鼠肝脏中不同水平的LPCs，从红色到绿色，LPCs含量逐渐升高。同时可观察到，相比于健康大鼠，患有脂肪肝的大鼠肝脏中的LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0含量均有降低，且LPC13∶0、LPC15∶0的含量最少。

3 结 论

本研究建立了FTICR-MS检测生物样品中4种LPCs的分析方法。样品采用甲醇-氯仿(9∶1,体积比)进行超声提取,通过利用高分辨率FTICR-MS，实现了4种LPCs的高灵敏、高准确检测，并成功应用于实际样品。该方法操作简单，质谱检测结果更为灵敏、准确，回收率高，精密度好，可满足生物样品中LPC13∶0、LPC15∶0、LPC16∶0、LPC18∶0的检测要求。