固相萃取/液相色谱-串联质谱法测定油脂中的3-氯-1,2-丙二醇棕榈酸二酯

尹 峰，杨冰洁，李 靖，李克静，李淑娟

(中国检验检疫研究院综合检测中心，北京 100123)

食品中氯丙醇脂肪酸酯的污染以3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯(3-Chloro-1,2-propanediol fatty acid esters,3-MCPDEs)最为严重，国内外对其在食品中的检测技术研究报道亦最多，其水解产物3-氯-1,2-丙二醇(3-Chloro-1,2-propanediol,3-MCPD)对人体有很强的毒副作用[1]。2013年，国际癌症研究机构(International agency for research on cancer,IARC)将3-MCPD列为2B类致癌物，即可能对人有致癌作用。目前国际上尚无氯丙醇脂肪酸酯的限量标准，2017年粮农组织/世卫组织食品添加剂联合专家委员会(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives and Contaminants(FAO/WHO),JECFA)推荐3-MCPD当量(游离3-MCPD及3-MCPDEs总和)的每日耐受摄入量(Tolerable daily intake，TDI)为4 μg/kg体重/天[2]，2018年欧洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)推荐其TDI为2 μg/kg体重/天[3]。氯丙醇脂肪酸酯具有种类和结构多样性，其可由单氯取代的氯丙醇(Monochloropropanediol esters,MCPD)和双氯取代的氯丙醇(Dichloropropanol esters,DCP)的任一个或两个羟基与食品中天然存在的任何脂肪酸结合形成。虽然脂肪酸的种类相对丰富，但常仅需要考虑核心的6或7种[4]，在植物油中，棕榈酸、油酸、亚油酸、硬脂酸、亚麻酸等与3-MCPD形成的12种对称或不对称二酯最广泛存在[5]，且以3-氯-1,2-丙二醇棕榈酸二酯(3-MCPD-DP)的检出率最高[6]，最高检出含量可达0.5 mg/kg。

测定氯丙醇脂肪酸酯含量的方法主要有气相色谱-质谱法[7-11]、液相色谱-串联质谱法[5-6,12-14]、超临界流体色谱-质谱法[15]、液相色谱-飞行时间质谱法[16]等。液相色谱-质谱法可用于氯丙醇酯结构类型、代谢动力学等的研究，与气相色谱-质谱法相结合，能更好的研究食品中氯丙醇酯的污染来源，控制此类污染物的迁移。目前液相色谱-质谱法前处理主要采用硅胶柱与C18柱双柱联合净化[5,13-14]，在实操上较繁琐；或采用基质辅助固相萃取净化[6,12]，但在净化效果方面存在不足。

EFSA报告[17]显示动植物油脂中氯丙醇酯的污染较普遍，且以棕榈油脂中的含量最高。本研究以植物油为样本，以污染最普遍的3-MCPD-DP为研究对象，采用实验室自填装PSA+C18吸附剂的固相萃取柱净化，有效减少了油脂对仪器的污染，获得了一种操作简便、灵敏度较高的可用于油脂中3-MCPD-DP检测的固相萃取/液相色谱-质谱联用方法。本方法可为建立油脂中其他氯丙醇酯类物质的液相色谱-质谱检测方法提供技术参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1290-LC/6460-MS高效液相色谱-串联质谱仪(美国Agilent公司)；Milli-Q 超纯水机(美国 Millipore 公司)；PL303型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；SI VortexGenie2漩涡混合器(美国Scientific Industries公司)；12孔固相萃取装置(美国Supelco公司);N1-05型氮吹浓缩仪(中国上海乞饶仪器公司)。

3-MCPD-DP、D5-3-MCPD-DP标准品(≥98.0%，加拿大Toronto公司)；甲醇、乙腈、正己烷、异丙醇(色谱级，美国Fisher公司)；甲酸铵(色谱级，美国Sigma公司)；C18、PSA吸附剂(美国Agilent公司)；实验用水为 Milli Q超纯水。

取适量3-MCPD-DP及D5-3-MCPD-DP标准品，用正己烷溶解，得到1 mg/mL 3-MCPD-DP及250 μg/mL D5-3-MCPD-DP标准溶液，置于-18 ℃下避光贮存。准确移取适量上述标准溶液，用乙腈-异丙醇(1∶1，体积比)溶液稀释，配制成不同质量浓度的系列混合标准工作溶液，现用现配。

1.2 样品前处理

称取油脂样品0.100 g于10.0 mL比色管中，加入100 μL 1 μg/mL 的D5-3-MCPD-DP标准使用液，用乙腈-异丙醇(1∶1)溶液溶解定容。称取PSA、C18吸附剂各500 mg，混匀后填充于带筛板的固相萃取空管中。该固相萃取柱分别经5 mL乙腈、异丙醇活化后，准确移取2.0 mL样液于固相萃取柱中，滤液弃去，用4 mL乙腈-异丙醇(2∶8)溶液洗脱，40 ℃水浴下氮吹至干，甲醇定容至1 mL，0.22 μm尼龙滤膜过滤，滤液供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3 液相色谱条件

ThermoFisher Accucore C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；柱温为45 ℃；流动相A为甲醇-水(96∶4，含10 mmol/L甲酸铵)，流动相B为异丙醇-水(96∶4，含10 mmol/L甲酸铵)；流速为0.3 mL/min；进样体积为10 μL。梯度洗脱程序为0～9.0 min，0%B；9.0～9.5 min，0%～10%B；9.5～11.5 min，10%B；11.5～13.5 min，10%～100%B；13.5～15.5 min，100%B；15.5～16.0 min，100%～0%B；16.0～20.0 min，0%B。

1.4 质谱条件

离子源：ESI源，正离子模式；监测模式：多反应监测(MRM)；气流温度：350 ℃；气流速度：10 L/min；雾化气压力：241 kPa；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：12 L/min；毛细管电压：4 000 V；喷雾电压：1 000 V；3-MCPD-DP的监测离子对：604.5/330.6(定量离子对)和604.5/239.0，裂解电压：80 V，碰撞能量分别为15 eV和12 eV；D5-3-MCPD-DP的监测离子对：609.5/335.7，裂解电压：70 V，碰撞能量：15 eV；加速器电压：3 V。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 离子化条件的优化氯丙醇酯在电喷雾离子源下不易形成[M+H]+，在铵盐或钠盐存在时，可离子化为[M+NH4]+或[M+Na]+，但钠盐易造成质谱仪的污染，不利于仪器的维护与使用[18]。本方法使用铵盐考察3-MCPD-DP的离子化条件，当流动相中分别含2、5、10 mmol/L乙酸铵时，对1 μg/mL的3-MCPD-DP标准溶液在ESI源正/负离子模式下进行全扫描。结果显示，在ESI(+)模式下，乙酸铵浓度为2 mmol/L和5 mmol/L时均得不到[M+NH4]+，在10 mmol/L时能得到稳定的[M+NH4]+；而在ESI(-)模式下均得不到相应的母离子。随后在MRM模式下发现定量离子对604.5/330.6的峰面积在流动相中含10 mmol/L乙酸铵时较20 mmol/L乙酸铵时更强。进一步比较了定量离子对分别在10 mmol/L甲酸铵、乙酸铵下的峰面积，发现其在甲酸铵溶液中具有更高的响应。最终确定以10mmol/L甲酸铵促进3-MCPD-DP在离子源中的离子化。

2.1.2 色谱柱的选择考察了ThermoFisher Accucore C18(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)、Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、Waters Acquity HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)、Capcell pak C18MGⅢ(2.0 mm×100 mm,3 μm)、Agilent XDB C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm)5种不同反相色谱柱在“1.3”洗脱程序下对3-MCPD-DP 的分离效果。结果显示，3-MCPD-DP在上述色谱柱上均能获得较好的分离度，且杂质峰的形状和洗脱顺序基本一致，但保留时间有较大差异，其中Waters Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)与ThermoFisher Accucore C18(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)保留时间基本一致，而其他3种色谱柱的保留时间延迟4～8 min，峰宽增加，且灵敏度降低。最后选择ThermoFisher Accucore C18(2.1 mm×100 mm,2.6 μm)作为分析用色谱柱，以获得较合适的保留时间、较低的系统压力，且在流动相梯度上也更具选择性。

2.1.3 流动相的优化将基质加标的橄榄油样品(含 200 ng/mL 3-MCPD-DP)净化后，与同浓度的溶剂标准溶液比较，上机考察二者的保留时间、峰面积、峰宽及绝对回收率等，以确定最佳的流动相洗脱条件。结果显示，在C18色谱柱上，随着保留时间的延长，溶剂标液的峰面积逐渐变大，之后保持一定水平,峰宽变宽。但相同条件下基质加标样品的绝对回收率不呈此趋势，显然基质的存在影响了样品中目标物的响应。选择绝对回收率最高的实验条件，以全扫描模式考察目标物与杂质的共流出情况，发现目标物峰与杂质峰基本实现了基线分离，即该条件下可有效降低基质效应。最终，流动相A采用甲醇-水(96∶4，含10 mmol/L甲酸铵)，流动相B采用异丙醇-水(96∶4，含10 mmol/L甲酸铵)按“1.3”的梯度洗脱条件进行分离。在该条件下，3-MCPD-DP标准溶液和实际样品的MRM色谱图见图1，可见在保留时间处较好地排除了杂质峰的干扰，峰较窄，可获得最佳的分析效果。

图1 标准溶液(A)和实际样品(B)中3-MCPD-DP的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 3-MCPD-DP in standard solution(A) and real oil sample(B)

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1 定容液的选择采用甲醇、乙腈、异丙醇、乙腈-异丙醇(1∶1)4种溶剂作为定容液对3-MCPD-DP的分离效果进行比较。结果发现，异丙醇作为定容液时，3-MCPD-DP的色谱峰分叉且峰宽；乙腈-异丙醇(1∶1)作为定容液时，峰形有改善，但信噪比较低，峰形分叉且不对称，推测与这两种定容液同初始流动相甲醇不能迅速互溶成均匀溶液有关，通过目测亦发现异丙醇与甲醇的互溶速度比乙腈与甲醇的溶解速度慢，因此这两种溶剂均不适合作为定容液；而采用甲醇、乙腈做为定容液时色谱峰对称、峰宽窄、信噪比高(见图2)。实验最终选择与初始流动相具有更好互溶性的甲醇为定容液。

图2 3-MCPD-DP在不同定容液下的色谱图Fig.2 Chromatograms of 3-MCPD-DP in different solutionsa.isopropyl alcohol;b.acetonitrile-isopropyl alcohol(1∶1);c.methanol;d.acetonitrile

2.2.2 固相萃取柱吸附剂用量的选择C18可吸附油脂样品中的三酰基甘油及蜡质[6]，PSA因具有较强的离子交换能力和络合作用，可吸附油脂中的脂肪酸、有机酸、极性色素、酚类及金属离子等[19]，将两种吸附剂同时使用可明显改善油脂样品的净化效果。分别取等重的PSA、C18吸附剂混合均匀后装入SPE空管中压实,即得分析用固相萃取柱。进一步对吸附剂用量进行优化，分别称取PSA、C18吸附剂各100、200、300、400、500、600、700、800 mg等比例混合装柱后，将1.0 mL 3-MCPD-DP加标浓度为100 ng/mL的橄榄油样液上柱净化，乙腈-异丙醇(1∶1)洗脱，收集5 mL，经氮吹至干，甲醇定容，过滤膜后上机测试比较。同时取100 ng/mL溶剂标准溶液按同样方法处理，以比较基质存在与否时吸附剂对3-MCPD-DP的影响。结果显示，溶剂标液与基质加标样液在净化柱中具有不同的洗脱行为，随着吸附剂含量的增加，溶剂标液的峰面积依次降低，表明吸附剂对溶剂标液中的3-MCPD-DP有吸附作用，且吸附剂含量越高，吸附的目标物也越多。而基质加标样液中，3-MCPD-DP的峰面积基本处于同一响应水平，说明存在基质时，吸附剂用量的增加不会影响3-MCPD-DP的响应，这可能是吸附剂优先与样品基质相互作用所致；且在上标净化样品量相同的条件下，吸附剂用量的增加对基质的净化效果无明显差异。考虑到不同样品基质的差异，为保证吸附剂活性位点的充足性，最终选择PSA、C18吸附剂均500 mg作为有效吸附剂用量。

图3 不同洗脱溶剂的洗脱曲线Fig.3 Elution curves of different elution solvents

2.2.3 固相萃取柱洗脱条件的优化采用PSA+C18吸附剂用量均为500 mg，乙腈-异丙醇(1∶1)为洗脱液时，通过研究不同称样量、不同洗脱体积下3-MCPD-DP的峰面积响应以确定最佳样品净化量。分别称取0.1、0.1、0.2 g橄榄油样品，基质加标使含100 ng/mL 3-MCPD-DP，分别移取1、2、1 mL样液上柱净化，并从上柱起每1 mL乙腈-异丙醇(1∶1)溶液收集，建立洗脱曲线。结果显示，初始1 mL时目标物的峰面积响应均可忽略不计，前7 mL洗脱的目标物均可达98%以上，最终以称样量0.1 g,上柱净化体积2 mL为最优样品净化量。

同时通过研究PSA+C18吸附剂用量均为500 mg时，不同洗脱溶液下的洗脱曲线以确定最佳洗脱液。在前述研究中，使用乙腈-异丙醇(1∶1)为洗脱液时，需7 mL才能洗脱98%以上的目标物，因此考虑增加洗脱液强度，使目标物更早洗脱。在此固相萃取柱中，异丙醇比乙腈具有更强的洗脱能力，因此比较了乙腈(ACN)与异丙醇(IPA)的体积比分别为1∶1、2∶8、0∶10时的洗脱曲线。结果显示乙腈与异丙醇的体积比为2∶8时，目标物能更早地洗脱，且较体积比为0∶10时具有更低的基质效应。从峰面积来分析，体积比为2∶8时目标物的洗脱更集中，在第3～6 mL时洗脱量可达98%以上。最终，确定洗脱液为乙腈-异丙醇(2∶8)，弃去初始2 mL流出液，收集4 mL洗脱液为最佳洗脱条件(见图3)。

2.3 基质效应的评价

取阴性油脂样品，以净化后的空白样品基质溶液配制基质匹配标准溶液，与甲醇溶液配制的同浓度标准溶液的峰面积进行比较，当比值为80%～120%时，表明基质效应较小[19]，以此来衡量方法的基质效应。实验结果显示，当称样量为0.1 g且经净化时，基质匹配标准溶液的峰面积与溶剂标准溶液的峰面积比约为67%；当称样量为0.2 g且经净化时，峰面积比约为43%；当称样量为0.2 g且未经净化时，峰面积比仅为18%。表明样品经前处理后得到一定程度的净化，但不能完全消除基质效应。因此，实验选择称样量0.1 g，并采用同位素内标法以降低基质效应，此时可直接采用溶剂标准曲线进行内标法定量分析。

2.4 线性范围、检出限与定量下限

移取适量3-MCPD-DP标准溶液和D5-3-MCPD-DP标准溶液，用甲醇逐级稀释，得到浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/mL的系列标准工作溶液，上机测定。以3-MCPD-DP与D5-3-MCPD-DP标准溶液的峰面积比为纵坐标，质量浓度比为横坐标，绘制标准曲线，获得线性方程。结果表明，3-MCPD-DP在0.5～1 000 ng/mL范围内线性关系良好(r2>0.999)；以信噪比S/N≥3和信噪比S/N≥10计算检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，测得LOD可达0.025 mg/kg，LOQ可达0.050 mg/kg。

2.5 回收率与相对标准偏差

称取橄榄油样品20份，其中2份做本底，其他18份分成3组(每组6份)，分别按低、中、高3个水平添加0.1、0.2、0.5 mg/kg的3-MCPD-DP，加入100 μL 1 μg/mL的D5-3-MCPD-DP工作液，经净化后进行测定，计算方法回收率和相对标准偏差(RSD)。结果显示，在上述3个加标水平下该方法的平均回收率分别为90.8%、102%、100%(n=6)，相应的RSD分别为1.1%、3.0%、1.5%(n=6)，均满足GB/T 27404-2008附录F[20]的要求。

2.6 实际样品的分析

为了考察了本方法对其他品种食用油脂的适用性，对市售玉米胚芽油、大豆油、花生油等3种不同油脂中的3-MCPD-DP含量进行平行检测，并分别加标0.5、1.0 mg/kg以考察加标回收率。结果发现，玉米胚芽油中3-MCPD-DP实际含量为0.063 mg/kg，2种加标水平下的回收率分别为106%、108%，其RSD为1.8%；大豆油及花生油均未检出，其中2种加标水平下大豆油的回收率均为109%，其RSD为0.1%；花生油的回收率分别为 103%和97.4%，其RSD为3.7%。本方法可用于玉米胚芽油、大豆油、花生油3种不同油脂中3-MCPD-DP含量的测定。

3 结 论

本研究建立了实验室自填装PSA+C18吸附剂的固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱法检测油脂中3-MCPD-DP的方法。该方法操作简便、结果准确，通过固相萃取柱净化，可有效去除油脂的基质干扰，方法的灵敏度、适用性及确证可靠性等方面均符合质量控制要求，在实用性上可满足油脂中3-MCPD-DP的准确定量检测。