环状RNA PTENP1、HIPK3在甲胎蛋白阴性的肝细胞癌患者中的表达及意义

肝细胞癌患者约占原发性肝癌患者的85%，中国肝细胞癌发病和病死人数占世界总数的50%[1]，及早诊断和准确评估病情是提高疗效和改善预后的关键。目前临床上主要依靠影像学和甲胎蛋白(AFP)对肝细胞癌进行诊断和病情评估，但约有30%～40%肝细胞癌患者的血清AFP处于正常水平(AFP<25 μg/L)，这类患者称之为AFP阴性肝细胞癌患者，因此，单独检测血清AFP存在较高的误诊及漏诊率[2]。以往研究显示，AFP阴性肝细胞癌患者的瘤体通常较小，易漏诊[3]。因此，寻找可靠的诊断标志物一直是临床研究的热点。有研究发现环状RNA(circRNA)PTENP1、HIPK3通过多种途径参与了肝细胞癌的发生、进展[4-5]，在肝细胞癌患者血清中异常表达，但其在AFP阴性肝细胞癌中的研究较少。本研究检测了AFP阴性肝细胞癌患者、肝脏良性病变患者及健康人群血清中PTENP1、HIPK3表达情况，并初步探讨了其在AFP阴性肝细胞癌诊治中的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2016年6月至2019年3月期间在西安大兴医院收治并确诊的51例AFP阴性(AFP≤30 μg/L)肝细胞癌患者设为肝细胞癌组，38例肝脏良性病变患者设为良性病变组(肝细胞腺瘤8例，肝炎后肝硬化21例，先天性肝囊肿9例)，另选择35名同期健康体检者设为对照组。肝细胞癌组和良性病变组均经肝穿刺活组织检查或术中病理切片确诊。纳入标准：(1)精神正常，意识清楚，能配合完成本研究；(2)年龄>18岁。排除标准：(1)合并其他部位肿瘤者；(2)入组前曾接受放射治疗、化学治疗或其他抗肿瘤治疗者；(3)精神疾病患者。所有入组者均知情同意，本研究经医院医学伦理委员会核准。收集研究对象的基本资料，包括年龄、性别、烟酒史及既往疾病史等，测量体质量、身高，计算体质指数(BMI)。3组的基本资料比较，差异无统计学意义，见表1。

表1 3组的基本资料比较

1.2 方法

采集研究对象的清晨空腹外周静脉血5 mL，3 000 r/min离心15 min，分离血清，置于-80 ℃冰箱保存待测。采用qRT-PCR法检测3组的血清PTENP1、HIPK3表达水平：根据试剂盒要求和步骤提取血清总微RNA(miRNA)后，进行逆转录反应，以cDNA为模板，进行PCR扩增及荧光定量检测。miRNA试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，采用2-△△Ct法计算PTENP1、HIPK3相对表达水平，重复检测3次，取平均值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析，计数资料采用卡方检验，二元Logistic回归计算PTENP1、HIPK3预测AFP阴性肝细胞癌的OR和95%CI，受试者工作特征(ROC)曲线分析PTENP1、HIPK3鉴别AFP阴性肝细胞癌的价值，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组的血清PTENP1、HIPK3表达水平比较

与对照组和良性病变组比较，肝细胞癌组的血清PTENP1表达水平明显降低，而血清HIPK3表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P均<0.05)；良性病变组的血清PTENP1、HIPK3表达水平与对照组比较，差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 3组的血清PTENP1、HIPK3表达水平比较()

注：与对照组比较，aP<0.05；与良性病变组比较，bP<0.05

2.2 血清PTENP1、HIPK3对AFP阴性肝细胞癌的发病风险预测

校正表1中基本资料后，单因素和多因素分析显示，血清PTENP1低表达水平和血清HIPK3高表达水平是AFP阴性肝细胞癌发病的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 血清PTENP1、HIPK3对AFP阴性肝细胞癌的发病风险预测

2.3 血清PTENP1、HIPK3对AFP阴性肝细胞癌患者的鉴别诊断效能分析

因变量为分类二变量，肝细胞癌组标记为1，对照组和良性病变组标记为0，自变量为血清PTENP1、HIPK3表达水平，ROC曲线分析提示，PTENP1、HIPK3联合检测的受试者工作特征曲线下面积(AUC)为0.951，大于PTENP1、HIPK3单独检测的0.756、0.855(Z=4.527，P=0.000；Z=3.561，P=0.000)，且联合检测可提高诊断的灵敏度和特异度(P<0.05)。见图1和表4。

图1 血清RNA PTENP1、HIPK3诊断AFP阴性肝细胞癌的ROC曲线

表4 血清PTENP1、HIPK3单独及联合鉴别诊断AFP阴性肝细胞癌的价值比较

3 讨论

肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤，具有发病率高、侵袭性强及预后较差等特点，因其发病隐匿，多数患者确诊时已进展至中晚期，是威胁人类健康甚至生命安全的主要疾病[6-8]。肝细胞癌早期诊断标志物的相关研究较多[9-12]，目前临床上仍采用AFP结合影像学检查的模式来诊断和评估病情。然而，对于肝细胞癌中30%～40%的AFP阴性患者，此模式局限性极大，易漏诊、误诊，且不能准确判断疗效及预后[13]。因此，另寻找有价值的指标来提高AFP阴性肝细胞癌的诊断、疗效监测及预后评估效能显得尤为重要。

随着分子基因研究领域的不断进展，各种分子基因作为标志物在各种肿瘤中的异常表达陆续被发现。circRNA是长链非编码RNA中的一种，具有种类丰富、进化保守及在机体中表达相对稳定等特性，具有作为标志物的潜质。以往研究发现，HIPK3异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关，并参与了肿瘤化学治疗耐药及胃癌的发生、进展等生物调控[14]；而PTENP1与miR-193a-3p相互作用，通过PTEN途径抑制肝细胞癌的迁移和侵袭，有望成为肝细胞癌的生物标志物[15]。目前这两种circRNA在AFP阴性肝细胞癌中的相关研究较少。本研究检测了AFP阴性肝细胞癌患者、肝脏良性病变患者及健康人群的血清PTENP1、HIPK3表达情况，结果发现与对照组和良性病变组相比，肝细胞癌组的血清PTENP1表达水平明显降低，而血清HIPK3表达水平明显升高(P<0.05)，良性病变组与对照组之间的差异则无统计学意义(P>0.05)，这提示血清PTENP1、HIPK3在AFP阴性肝细胞癌患者中差异表达，具备作为此类患者鉴别诊断的有价值的指标。进一步分析发现，血清PTENP1低表达水平和血清HIPK3高表达水平是AFP阴性肝细胞癌发病的独立危险因素(P<0.05)，这提示血清PTENP1、HIPK3在AFP阴性肝细胞癌的发病风险评估中具有较高的潜在价值。此外，本研究应用ROC曲线分析了血清PTENP1、HIPK3对AFP阴性肝细胞癌的鉴别诊断效能，结果显示血清PTENP1、HIPK3联合检测的AUC为0.951，大于PTENP1、HIPK3单独检测的AUC(0.756、0.855)，联合检测的敏感度为88.24%，特异度为91.07%，均高于单独检测，这提示血清PTENP1、HIPK3检测在AFP阴性肝细胞癌的鉴别诊断中均具有较高参考价值，且两者联合检测可提高诊断的敏感度和特异度。

本研究尚存在不足：为单中心研究，纳入病例可能会造成偏倚，影响结果的准确性；样本例数偏少；未能就PTENP1、HIPK3对AFP阴性肝细胞癌的具体作用机制进行探讨；未进行长时间随访不同的血清PTENP1、HIPK3表达水平对AFP阴性肝细胞癌患者预后的影响。这为后续研究指明了方向，为临床靶向治疗提供了参考。

综上所述，AFP阴性肝细胞癌患者存在血清PTENP1、HIPK3异常表达，两者联合检测具有较高的鉴别诊断和发病风险评估价值。