慢病毒介导miR-17过表达对溃疡性结肠炎小鼠的影响及机制初探

溃疡性结肠炎(UC)属于炎症性肠病(IBD)，好发于直肠和乙状结肠[1]。UC的发病机制目前尚未完全明确，其与环境、遗传、感染、细胞凋亡及免疫等多种因素相关。有研究显示，肠道黏膜细胞对维持肠道微生态平衡具有重要作用，而肠道黏膜细胞凋亡率升高将导致肠道黏膜屏障受损[2]。肠道黏膜屏障受损与UC久治不愈、病情反复密切相关。miR-17是由6个序列相似、结构相仿的核苷酸组成的RNA分子，其序列高度保守，存在于基因组中内含子的非编码区[3]。研究表明，miR-17主要与细胞凋亡、细胞周期调控相关[4]。本研究探讨了miR-17过表达对UC小鼠结肠组织的影响及可能的机制，以期为UC的治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级BALB/c小鼠，雄性，共45只，体质量为25～32 g。由中国医科大学提供，许可证号：SYXK(辽)2018-0087。室温保持22 ℃～28 ℃，相对湿度35%～75%，昼夜自然光照，适应性饲养1周。

1.2 主要试剂与仪器

试剂：2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)(美国Sigma公司)，裂解液(美国BD公司)，Tunel检测试剂盒(上海碧云天公司)，水合氯醛(天津福星公司)，BCA蛋白定量测定试剂盒(上海碧云天公司)，HE染色试剂盒(北京索莱宝公司)、RNA提取试剂盒、反转录试剂盒(美国Beyotime公司)，兔单克隆抗Bim抗体(美国PAA公司)，HRP标记羊抗兔二抗(上海碧云天公司)，SDS-PAGE凝胶配置试剂盒(南京建成公司)，ECL发光试剂盒(美国Thermo公司)。 仪器：垂直电泳槽、稳压稳流电泳仪、RT-PCR反应扩增仪(美国Bio-Rad公司)。本研究由沈阳万类生物公司设计引物，引物序列见表1。

1.3 分组与UC模型构建

35只小鼠适应性饲养1周后，禁食不禁水维持24 h，腹腔注射4%水合氯醛溶液(40 mg/kg)，待小鼠麻醉后，从小鼠的肛门插入直径为5 mm的硅胶管，进深约8 mm；该管另一端连接注射器，一次性注射2.5%TNBS乙醇溶液(TNBS溶于50 %的乙醇水溶液)灌肠(100 mg/kg)，灌肠完毕后，提拉尾巴使小鼠倒立3 min，放回原笼继续饲养，参照文献[5]制作UC模型。随机选取5只小鼠处死，取结肠组织进行病理学观察，判断小鼠UC模型构建成功与否。将30只UC模型构建成功的小鼠随机分成模型组(B组)、模型+空载体组(C组)、模型+miR-17过表达组(D组)，每组10只；另取10只小鼠用上述方法注射100 mg/kg的生理盐水灌肠，设为正常组(A组)。其中C组小鼠在第1、7、14、21天时于尾静脉注射慢病毒空载体100 μL；D组小鼠于相同时间点注射等量的miR-17过表达慢病毒载体；最后1次注射1周后处死全部4组小鼠，并将结肠组织存于-80 ℃冰箱中。

表1 引物序列

1.4 小鼠症状观察与评分

实验开始后，每日记录每只小鼠的体质量，观察每只小鼠的粪便情况以及便血情况，根据UC的疾病活动指数(DAI)标准，并参照文献[6]进行评分。具体如下：体质量无下降，粪便正常且无便血计0分；体质量下降<5 %，粪便松散且无便血计1分；体质量下降5 %～10 %，粪便松散有便血计2分；体质量下降11 %～15 %，稀便，有便血计3分；体质量下降>15 %，稀便，肉眼血便计4分。

1.5 HE染色观察小鼠结肠组织病理变化

将固定于4 %多聚甲醛溶液中的结肠组织取出，然后进行脱水、透明、石蜡包埋和切片，对组织切片进行脱蜡、水化、染色和封片。利用显微镜观察切片。

1.6 TUNEL法检测小鼠结肠组织细胞凋亡情况

将小鼠结肠组织从4%多聚甲醛溶液中取出，制成石蜡切片；采用3 %过氧化氢溶液室温孵育5 min，0.05 mol/L枸橼酸盐溶液100 ℃修复10 min，15%脱脂奶粉溶液封闭1 h，之后用1∶500 TUNEL检测液室温孵育90 min，1∶500荧光素抗体37 ℃孵育60 min，Hoechst室温孵育5 min，封片，利用荧光显微镜观察并拍照。结果判定标准：凋亡细胞的细胞核呈黄棕色或黄褐色，并且呈散状分布，周围无炎性细胞浸润，核固缩或核碎裂。凋亡指数=(凋亡阳性细胞核数/总细胞数)×100 %。

1.7 RT-PCR法检测小鼠结肠组织中Bim mRNA、PTEN mRNA的表达水平

从-80 ℃冰箱中取出小鼠结肠组织80 mg，加入RNAiso Plus 1 000 μL剪碎，研磨匀浆，室温中加入各项反应试剂，37 ℃温育，60 min；70 ℃温育10 min。以U6为内参，95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法对实验数据进行分析。

1.8 Western Blot法检测小鼠结肠组织中Bim蛋白的水平

从-80 ℃冰箱中取出小鼠结肠组织，加入裂解液[组织体质量(mg)∶裂解液(μL)=1∶9]，4 ℃离心20 min，提取上清液中的总蛋白，利用BCA蛋白检测试剂盒检测样本总蛋白浓度；随后加入25 %的上样缓冲液，沸水浴10 min变性；应用SDS-PAGE凝胶配置试剂盒进行电泳；完毕后将蛋白转移至PVDF膜上。1∶400兔单克隆Bim一抗4 ℃孵育过夜，1∶1 400 HRP标记羊抗兔IgG室温孵育1 h，用ECL发光液避光显影。应用Image J-pro 6.0 软件进行灰度值扫描分析，得出目的蛋白表达的相对值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 各组症状及DAI评分比较

A、B、C、D组小鼠DAI评分分别为(0.10±0.03)分、(3.60±0.05)分、(3.53±0.60)分和(1.57±0.36)分，差异有统计学意义(F=113.57，P<0.001)。与A组相比，B、C、D组小鼠的DAI评分均显著升高，差异具有统计学意义(q=22.112 7、21.670 5、9.287 3，P<0.05)。与B组相比，C组小鼠的DAI评分差异无统计学意义(q=0.442 2，P>0.05)，而D组则显著降低(q=12.825 4，P<0.05)。与C组相比，D组小鼠DAI评分显著降低，差异有统计学意义(q=12.383 1，P<0.05)。

2.2 各组小鼠结肠组织切片病理学比较

A组结肠组织细胞排列整齐，无明显的炎性细胞浸润及纤维化，也没有观察到任何病变。与A组相比，B、C组小鼠结肠组织出现明显的炎性细胞浸润及纤维化，D组较B、C组明显改善。见图1。

2.3 各组小鼠结肠组织TUNEL分析比较

A、B、C、D 组小鼠结肠组织细胞凋亡指数分别为(4.05±3.97)%、(77.68±5.89)%、(71.98±6.72)%和(30.20±8.64)%，差异有统计学意义(F=288.81，P<0.001)。与A组相比，B、C、D 组小鼠结肠组织细胞凋亡指数均显著升高，差异具有统计学意义(q=35.688 4、32.925 6，12.674 9，P<0.05)。与B组相比，C组差异无统计学意义(q=2.762 8，P>0.05)，而D组则显著降低(q=23.013 5，P<0.05)。与C组相比，D组小鼠结肠组织细胞凋亡指数显著降低，差异具有统计学意义(q=20.250 7，P<0.05)。见图2。

图1各组小鼠结肠组织光镜下的病理改变 HE染色 ×200A正常小鼠B模型组C模型+空载体组D模型+miR-17过表达组

图2各组小鼠结肠组织TUNEL分析 HE染色 ×200A正常小鼠B模型组C模型+空载体组D模型+miR-17过表达组

2.4 各组小鼠结肠组织中Bim mRNA、PTEN mRNA的表达水平比较

如表2所示，4组小鼠结肠组织中Bim mRNA、PTEN mRNA的表达水平相比较，差异有统计学意义(F=36.88、86.67，P<0.001)。与A组相比，B、C、D组小鼠结肠组织中Bim mRNA、PTEN mRNA的表达水平均显著升高，差异具有统计学意义(q=12.694 4、12.933 9、7.305 3，P<0.05；q=17.985 9、19.569 6、6.900 3，P<0.05)。与B组相比，C组小鼠结肠组织中Bim mRNA、PTEN mRNA的表达水平差异均无统计学意义(q=0.239 5、1.587 3，P>0.05)，而D组则均显著降低，差异具有统计学意义(q=5.389 1、11.085 7，P<0.05)。与C组相比，D组小鼠结肠组织中Bim mRNA、PTEN mRNA的表达水平均显著降低，差异具有统计学意义(q=5.628 6、12.669 3，P<0.05)。

表2 各组小鼠结肠组织中Bim mRNA、PTEN mRNA的表达水平

注：与A组比较，aP<0.05；与B组比较，bP<0.05；与C组比较，cP<0.05

2.5 各组小鼠结肠组织中Bim蛋白的表达水平比较

A、B、C、D组小鼠结肠组织中Bim蛋白的相对表达水平分别为0.39±0.16、0.93±0.17、0.70±0.18和0.36±0.18，差异具有统计学意义(F=17.25，P<0.001)。与A组相比，B、C组小鼠结肠组织中Bim蛋白的相对表达水平均显著升高，差异具有统计学意义(q=7.869 7、5.605 9，P<0.05)。与B组相比，C组小鼠结肠组织中Bim蛋白的相对表达水平差异无统计学意义(q=2.260 0，P>0.05)，而D组则显著降低(q=8.398 3，P<0.05)。与C组相比，D组小鼠结肠组织中Bim蛋白的相对表达水平显著降低，差异具有统计学意义(q=6.138 3，P<0.05)。见图3。

图3 各组小鼠结肠组织中Bim蛋白的表达

3 讨论

UC患者多伴有肠道炎性反应和肠道黏膜溃疡性损伤，主要表现为腹痛、腹泻等[7]。研究发现，UC是诱发结直肠癌的危险因素[8]。UC的病因较为复杂，其发病机制尚未完全阐明，多数学者认为其发病机制可能与遗传、环境、免疫、肠道菌群失调及黏膜细胞过度凋亡等因素有关[9-12]。UC反复发作可能是因结肠黏膜细胞凋亡增多导致屏障功能受损所致[13]。因此，抑制肠道黏膜细胞凋亡可能对UC的肠道屏障修复起重要作用。本研究给予小鼠2.5% TNBS乙醇溶液灌肠构建UC模型，通过慢病毒转染miR-17使之过表达抑制肠道黏膜细胞凋亡，观察UC小鼠的症状及结肠黏膜病理变化，并探究其机制。

本研究基于小鼠的症状、体征、DAI评分和小鼠结肠组织病理学检查，评价UC造模成功与否，结果显示，与正常小鼠相比，UC模型小鼠出现明显的UC症状及体征，并且DAI评分明显升高，小鼠结肠组织出现明显病理损伤，表明UC小鼠模型造模成功。本研究观察了慢病毒介导miR-17过表达对UC小鼠的影响，并通过光镜观察各组小鼠结肠的病理变化，结果表明过表达miR-17可能减轻UC小鼠结肠组织的病理损伤，使得溃疡得到抑制并逐渐愈合。本研究结果表明，UC小鼠结肠黏膜细胞的凋亡指数显著增加，导致溃疡加重，而过表达miR-17可使小鼠结肠黏膜细胞的凋亡指数明显下降；同时，本研究进一步验证了Bim mRNA、PTEN mRNA及Bim蛋白的表达情况，也得出上述结论。提示过表达miR-17可能是通过降低Bim蛋白表达而抑制了PTEN/Akt通路，下调UC小鼠结肠黏膜细胞的凋亡，从而使得UC小鼠的结肠组织溃疡受到抑制。

综上所述，过表达miR-17对UC小鼠具有保护作用，其机制可能与降低Bim蛋白表达及抑制PTEN/Akt通路有关，推测miR-17可能是UC的新靶点，但其具体机制还需要进一步探究。