MicroRNA与冠脉支架内再狭窄的研究新进展

包乙君 综述 赵然尊 审校

遵义医科大学附属医院心内科，贵州 遵义 563000

近年来冠心病严重威胁了人类的健康，已成为世界各国死亡的主要原因之一。目前冠心病主要治疗方案包括：改变生活方式、药物干预和血管重建术。其中经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)是主要的血运重建治疗策略。但PCI术后支架内再狭窄是影响远期疗效的最重要并发症之一。裸金属支架(bare metal stent，BMS)的使用消除了部分有利于形成再狭窄的因素，将再狭窄发生率从50%降低到20%～30%[1]；药物洗脱支架(drug eluting stent，DES)时代的到来将再狭窄率进一步降低至10%以下[2]。目前，对于再狭窄机制尚未完全阐明，支架置入后新生内膜形成和新生动脉粥样硬化形成是支架内再狭窄最重要机制。近年来研究显示，microRNAs可能通过多种途径或机制参与新生内膜形成、炎症反应以及新生动脉粥样硬化形成，进而涉及再狭窄。本文通过文献复习综述了microRNAs 在冠脉支架内再狭窄的发生机制以及防治等方面的研究新进展。

1 MicroRNAs概述

MicroRNAs (miRNAs)是一类内源性、小的非编码RNA，长度为19～25 个核苷酸，通过与靶信使RNA(miRNAs)的3'-非翻译区(UTR)结合，在转录后水平调控各种基因表达。1993 年第一个miRNA 即Lin-4 在秀丽隐杆线虫中被发现[3]。2002 年发布了主要miRNAs 数据库，包含来自五个物种的218 个microRNAs基因座，且总数仍持续增加[4]。最新的miRBase 序列数据库包含38 589 个条目，来自271 个生物的发夹前体microRNAs，这些发夹前体产生总共48 860 个不同的成熟microRNAs序列[5]。已知MicroRNAs参与调节心脏的多种疾病包括：心血管系统的发育、动脉粥样硬化、高血压、心律失常、心力衰竭、心血管疾病介入治疗再狭窄等[6]。

2 冠脉支架术后再狭窄的病理生理机制

冠脉支架术后再狭窄(in-stent restenosis，ISR)是指支架内全程和或支架两端5 mm 节段内的管腔丢失，导致管腔狭窄程度≥50%。而临床定义为需要靶病变或靶血管的血运重建症状性的再狭窄，表现为心绞痛或急性心肌梗死等。根据Mehran 分类系统，可以将ISR分为四型：①Ⅰ型，即局灶型，可以细分为连接型、边缘型、单一局灶型和多点局灶型；②Ⅱ型，即弥漫型；③Ⅲ型，即增殖型；④Ⅳ型，即闭塞型。因此了解ISR 的病理生理发生机制对ISR 的治疗更有指导意义。既往在普通球囊(无支架)血管成形术(plain old balloon angioplasty，POBA)中，ISR 的机制主要包括：血管重构和弹性反冲。而支架内血管成形术后的再狭窄涉及内皮损伤、内皮功能失调及新生内膜增殖和新动脉粥样硬化形成，其中新动脉粥样硬化的形成过程与内皮细胞的不完全再生有关，导致一系列的急性或慢性炎症反应，新生脂质的摄入过多以及新生内膜中动脉粥样硬化斑块加速发展[7]。由此，导致ISR 的三个主要过程是：弹性反冲、内膜增殖和新动脉粥样硬化形成。其中最重要的是内膜增殖，这主要是内皮损伤引发炎症反应，并且在介质中扩散变化，导致血小板、纤维蛋白的沉积以及巨噬细胞的黏附进而导致内膜增生；还有另一种现象主要是由于血管平滑肌的增殖及其随后的消融迁移，导致管腔变窄。许多研究发现microRNAs 是参与上述过程的重要调节因子[8]。

3 MicroRNAs调节内皮细胞参与再狭窄

一个正常的内皮系统非常重要，因为它参与了血管张力的调节，并通过抑制炎症、血栓形成及血管平滑肌细胞增殖和迁移来抑制内膜增生。支架植入术后引起内皮细胞(endothelial cell，EC)的机械性损伤，导致一系列炎症反应、血栓形成等，从而引起支架内再狭窄的形成。因此维持内皮细胞完整性及其正常功能对ISR的形成具有抑制作用。在血管内皮细胞中miRNA表达最高的是miR-126，它参与血管内皮功能障碍和血管发育的调节。有研究发现miR-126 是血管完整性的主要调节因子。它由血管内皮抑制素(VE-statin)基因的内含子7编码，也被称为EGF样结构域7 (EGFL7)，由E-26家族转录因子ETS1/2控制。在斑马鱼中敲低miR-126 会导致胚胎发育过程中血管完整性丧失和出血，miR-126 的功能部分是通过直接抑制VEGF 通路的负调节剂，包括Sprouty 相关蛋白、SPRED1 和磷酸肌醇3 激酶调节亚基2 (PIK3R2)产生的[9-10]。miR-221/222 族参与维持内皮细胞的稳态和支持内皮细胞静态表型。例如，将人肝窦形内皮细胞暴露于临床剂量的电离辐射会导致AMP 激活蛋白激酶(AMPK)和p38丝裂原激活，AMPK和p38 MAPK途径均通过上调基质金属蛋白酶2 (MMP-2)和血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2)来促进辐射诱导的人肝窦形内皮细胞血管生成行为[11]。有研究观察到辐射照过的人类脐静脉内皮细胞可诱导血管生成相关的miRNA 表达，包括miR-221/222 簇，它本身不支持新血管生成，但有助于维持已组装的新血管内皮细胞的稳定性和完整性[12]。实际上，在EC中，miR-221/222簇显示出抗血管生成活性，并阻止了内皮向血管重塑和新血管形成的激活。miR-221/222 负责建立EC 的静态表型并维持血管内皮的稳态。

内皮型一氧化氮合酶(eNOS)在内皮功能的调节中起着至关重要的作用，并通过产生一氧化氮(NO)来充当血管张力和体内平衡的主要调节剂。NO的产生对于促进内皮完整性和内皮再生至关重要，最近已报道鸟苷三磷酸环水解酶1 (GCH1)是miR-133a 的靶标。GCH1 缺乏对于内皮功能障碍中eNOS 解偶联至关重要。miR-133a在内皮细胞中的异位表达参与了许多种心血管疾病(CVD)危险因素诱导的内皮功能障碍。有趣的是，他汀类药物通过抑制异常的miR-133a 表达来预防内皮功能障碍，从而上调GCH1 基因表达[13]。此外，miR-199a-3p 与miR-199a-5p[14]、miR-155[15]、miR-21[16]也参与NO 失调的内皮功能障碍。关于支架植入后受损冠状动脉的再内皮化这样的结构提供了一个非生理表面黏合，并产生了较高的剪切引力，而高剪切应力则损害EC 功能[17]。最新的研究表明miR-93 和miR-484 受剪切引力的调节参与内皮细胞功能障碍[18]。

4 MicroRNAs调节炎症反应参与再狭窄

支架植入术后引起内皮损伤，促使一系列炎症反应。炎症反应参与冠脉支架术后再狭窄各个阶段，对平滑肌细胞的表型转换、增殖及迁移，动脉粥样硬化的发展及新生动脉粥样硬化的形成等都尤为重要。EC的损伤使EC活化，激活EC后，它们会表达单核细胞趋化蛋白1、白介素(IL)-8、细胞间黏附分子1(ICAM-1)、血管黏附分子1 (VCAM-1)、E选择素、P选择素和其他炎性因子，吸引淋巴细胞和单核细胞与内皮结合并浸润到动脉壁中，炎症由此便开始发生[19]。此过程涉及许多细胞和细胞因子的参与[20]，ZHU 等[21]发现miR-155和miR-221/222通过靶向血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的血管紧张素Ⅱ型受体(AT1R)或转录因子Ets-1参与内皮炎症和EC 迁移。YANG 等[22]证实了Smad3 是miR-216a的潜在靶标基因，miR-216a抑制Smad3蛋白表达并介导下游IκBα降解，从而激活了内皮细胞中N-κB响应黏附分子(如ICAM1 和VCAM1)，从而促进了内皮细胞对单核细胞的黏附能力，进而促进内皮炎症。ZHENG 等[23]证明了miR-24 的过表达显著抑制importin-α3(KPNA4)基因的转录和翻译，并负调控内皮炎性因子TNF-α的表达。miR-24 通过阻断NF-κB信号通路、调节内皮细胞的炎症以及抑制血管内皮细胞的增殖和迁移而发挥其在动脉粥样硬化中的作用。SU 等[24]研究发现，miR-181a-5p 和miR-181a-3p通过分别靶向TAB2 和NEMO 来阻断NF-κB 激活和血管炎症，从而延缓动脉粥样硬化的发展，进而抑制血管炎症和动脉粥样硬化。

内皮的损伤到炎症的激活，再到单核细胞成为组织巨噬细胞并内化脂蛋白颗粒并产生泡沫细胞(新生动脉粥样硬化的标志)，泡沫细胞分泌炎性细胞因子、活性氧和其他介质；巨噬细胞会死亡，包括通过凋亡而死亡，形成成熟斑块的脂质或“坏死”核心；巨噬细胞的作用放大了局部炎症反应。YANG 等[25]证明了miR-155 在oxLDL 刺激的巨噬细胞中促进炎症和巨噬细胞迁移增强了STAT3和NF-κB信号传导，促进动脉粥样硬化炎症。CEOLOTTO 等[26]通过对有和没有动脉粥样硬化的患者的血浆样本中筛选了一组179种分泌的microRNA，并在随访至11 年的患者中进行了横断面和前瞻性验证，发现miR-30c-5p通过清除剂受体CD36 被氧化的LDL (oxLDL)下调，并通过Dicer 抑制miR加工。反过来，miR-30c-5p的下调负责oxLDL对巨噬细胞IL-1β释放，Caspase-3 表达和凋亡的影响，并确定了miR-30c-5p在微粒中的减少是早期动脉粥样硬化的启动子，它通过传递促炎性促凋亡信号和损害内皮细胞的愈合来实现。

5 MicroRNAs调节血管平滑肌细胞参与再狭窄

在生理条件下，血管平滑肌是一种高度特化的几乎静止的细胞群，其主要功能是维持血管张力，确保血管的收缩。它们在成熟血管中呈现分化状态，增殖率较低(≈5%)，表达一组特殊的收缩蛋白(如平滑肌肌球蛋白重链、平滑肌肌动蛋白、Calponin等)。然而，血管平滑肌细胞具有显著的可塑性，可以很容易地进行表型转换，在炎症反应和各种炎症介质(包括细胞生长因子和趋化因子等)的刺激下，从高度专一化的收缩状态转变为合成或增殖状态，随后增殖和迁移速度增加，收缩蛋白的表达水平降低[8]。血管平滑肌细胞的表型转换、增殖及迁移参与再狭窄，在这种情况下许多microRNAs 参与血管平滑肌的调控。众所周知，miR-143和miR-145被认为是血管发育过程中和血管疾病中血管平滑肌细胞表型转换的主要调节因子[27]，其表达模式与α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)、平滑肌肌球蛋白重链和calponin 表达所定义的分化表型相关[12]。miR-125a-5p 在血管平滑肌细胞中高表达，但在血管损伤后表达下调。它的过度表达足以减少血管平滑肌细胞的增殖和迁移，并能促进选择性血管平滑肌细胞标志物如α-平滑肌肌动蛋白(ACTA2)、肌球蛋白重链11 (MYH11) 和 平 滑 肌22 α (SM22 α) 的 表 达。miR-125a-5p直接靶向ETS-1是一种参与细胞增殖和迁移的转录因子，在血管平滑肌细胞PDGF-BB 途径中起关键作用。miR-125a-5p可抑制PDGF-BB通路，因此其是VSMCs 表型开关的潜在调节因子[28]。miR-21 也参与血管平滑肌细胞表型转换的调节，HUANG 等[29]的实验证明了miR-21 不仅在促进人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)的α-肌动蛋白中起重要作用，而且还通过AKT 和ERK 信号通路改变了人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)的细胞形状，进一步证明了miR-21是调节血管平滑肌细胞增殖、迁移的重要调节因子。

在血管再狭窄中miR-221 和miR-222 两种miRNAs均能促进血管平滑肌细胞增殖。是通过抑制靶基因p27 (Kip1)和p57 (Kip2)来实现的，miR-221 和miR-222的基因敲除减弱了血管成形术后大鼠颈动脉内膜增生[30]。最近的一份报告还报道了糖尿病小鼠血管平滑肌细胞和动脉中miR-221和miR-222水平的升高。有趣的是，抑制这两种miRNAs可防止糖尿病动脉损伤引起的血管平滑肌细胞异常增殖[31]。FENG等[32]实验发现，体内颈动脉损伤后的大鼠血管平滑肌细胞中miR-93 上 调。miR-93 是通过Raf-ERK1/2 途径介 导的血管平滑肌细胞增殖和迁移的发生。 此外，TORELLA等[33]的实验表明，miR-133在体外和体内均在血管平滑肌细胞(VSMC)中稳定表达，发现miR-133参与了血管平滑肌细胞增殖和迁移的调控。腺病毒介导的miR-133 的过度表达可以减弱球囊损伤后的内膜形成，而抑制其内源性水平则会产生相反的作用。值得注意的是，miR-133通过靶向转录因子Sp-1和Moesin 减少了血管平滑肌细胞的增殖和迁移[34]。SUN等[35]研究发现miR-206在损伤血管壁增殖性血管平滑肌细胞中的表达明显增加，miR-206 通过靶向ZFP580 参与血管成形术后血管平滑肌细胞的表型转换和新生内膜病变的形成。 通过慢病毒介导的miR-206 减少了球囊损伤后新生内膜的形成，这些发现可能为血管成形术后再狭窄提供新的治疗靶点。miR-181b通过激活PI3K和MAPK信号通路促进血管平滑肌细胞的增殖和迁移。根据这一结果，抑制内源性miR-181b 可抑制大鼠颈动脉成形术后新生内膜增生[36]。据报道，miR-663通过负调控JUNB和肌球蛋白轻链9 (MLC9)靶向作用于人血管平滑肌细胞的迁移和分化标志基因。此外，miR-663 在体内的过表达减少了小鼠颈动脉结扎所致血管损伤后新生内膜损伤的形成[37]。miRNAs介导的抑制平滑肌细胞增生和新内膜形成的例子还包括miR-9[38]和miR-599[39]。

6 MicroRNAs涉及新生动脉粥样硬化

支架内新生动脉粥样硬化(in-stentneoatherosclerosis，ISNA)的形成过程与内皮细胞的不完全再生有关，导致一系列的急性或慢性炎症反应、新生脂质的摄入过多以及新生内膜中动脉粥样硬化斑块的加速发展[7]。ISNA 的形成这个概念最早在2010 年被提出。关于microRNA 与新生动脉粥样硬化之间的关系，可能与microRNA调节内皮细胞的完整性、炎症反应等有关，如上所述，但目前尚未明确提出关于调节ISNA有关的microRNA。

7 总结

针对心血管疾病介入治疗再狭窄的问题，多数学者认为该过程是多因素共同导致的，包括：炎症因子的激活、内皮细胞的不全再生、平滑肌细胞的增殖、迁移、新动脉粥样硬化的形成等。目前有多种治疗方法可用于治疗冠脉支架内再狭窄，而且治疗通常涉及不止一种技术，包括：药物治疗、旧球囊血管成形术(POBA)、血管近距离放射疗法(VBT)、切割球囊等。然而心血管介入治疗再狭窄的问题，仍然是目前的热点问题，需要提出新的针对支架内再狭窄的解决手段。MicroRNAs 被发现参与心血管介入治疗再狭窄的多种调节，因此基因洗脱支架的新发展是支架技术的重大突破。这种支架不仅可以提供抗炎和抗血栓药物，还可以携带miRNA和siRNA等ncRNA。此外，目前对心血管疾病介入治疗再狭窄的认识还很有限。因此，尽管ncRNA在动物模型和临床试验中显示出潜在的益处，但心血管疾病患者的ncRNA支架植入仍有很长的路要走。