长链非编码RNA与血管钙化机制的研究进展

徐通洁，刘勇

血管钙化是一种常见的病理表现，多见于动脉粥样硬化、糖尿病、慢性肾脏疾病等，是导致心血管疾病高患病率和高病死率的直接因素之一。近年来发现长链非编码RNA（LncRNA）可通过与微小RNA（miRNA）相互作用或其他途径参与调节调控血管钙化的过程。本文将介绍LncRNA的功能和特点，并在已有研究基础上对不同LncRNAs参与调节血管钙化的机制做一综述。

血管钙化是心脑血管疾病发生的共同基础，主要表现为动脉硬度增加以及动脉顺应性降低，是引起心脑血管疾病患者死亡的重要因素，且受多种因素调节。既往研究发现，血管钙化是一个主动、可调节的生物学过程，其过程与骨形成类似，并涉及一些骨相关蛋白的表达，如碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）、Runt相关转录因子2（Runx2）和骨形成蛋白-2（BMP-2）等[1]。临床将血管钙化分成四类：动脉粥样硬化钙化、动脉中膜钙化、心脏瓣膜钙化和血管钙过敏[2]。

长链非编码RNA（即LncRNA）种类众多, 但目前功能明确的LncRNA数量极少。LncRNA可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平等3个层面调控基因的表达[3]，并广泛参与机体几乎所有生理和病理过程。已有研究结果表明LncRNA与心血管系统疾病发生及发展有着密切联系。

1 LncRNA的结构与功能

长链非编码RNA属于非编码RNA中长度超过200核苷酸单位的功能性RNA分子，位于细胞核或胞质内，缺乏编码蛋白的能力[4]。Okazaki等[5]首次在小鼠全长互补DNA（cDNA）的大规模测序过程中发现了这类新的转录物，即LncRNA。Ponting等[6]研究表明，LncRNA的来源主要为五种：①编码蛋白的基因结构中断形成一段LncRNA；②两个未转录的基因与原来分离很远的基因串联, 产生含多个外显子的LncRNA；③非编码基因在复制过程中的反转录作用复制从而产生LncRNA；④局部的复制子串联产生LncRNA；⑤位因子插入产生一个有功能的LncRNA。虽然LncRNA来源不一，但研究显示它们在基因表达的调控方面有相似作用[7]，如：参与染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要调控过程[8]。LncRNA的作用方式包括[9]：①在编码蛋白基因的上游启动子区转录，干扰邻近蛋白编码基因的表达；②抑制RNA聚合酶Ⅱ，或介导染色质重构和组蛋白修饰，影响下游基因表达；③通过与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，进而干扰mRNA剪切，产生不同的剪切形式；④与编码蛋白基因的转录本形成互补双链,在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，调控基因的表达水平；⑤结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性；⑥作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；⑦结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位；⑧可作为小分子 RNA（如miRNA、piRNA、mascRNA）的前体分子[10]。新近研究发现：竞争性内源性RNA（ceRNA）是稳定的LncRNA，其大量积累并以不同方式调节基因表达，包括作为micRNA的诱饵或海绵，从而竞争性抑制miRNA与靶mRNA相互作用的能力[11-13]。Lv等[14]证明LncRNA H19/miR-675/PTEN是平滑肌细胞增殖的信号传导轴。另有研究表明LncRNA H19通过海绵吸附miR-148b，从而促进氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人主动脉平滑肌细胞的增殖，并抑制细胞凋亡[15]。

2 促进血管钙化相关的LncRNAs

2.1 LncRNA TUG1RUNX2是细胞钙化的重要转录因子，通常情况下，血管平滑肌细胞并不表达RUNX2[16]。Cong等[17]研究发现：LncRNA TUG1可通过海绵作用吸附miR-204-5p并上调Runt相关转录因子2（Runx2）的表达，从而促进主动脉瓣膜钙化。在β-甘油磷酸诱导的主动脉瓣膜间质细胞钙化模型过程中，LncRNA TUG1和RUNX2含量明显升高，而miR-204-5p含量明显降低。通过细胞转染sh-TUG1降低LncRNA TUG1的表达，能明显促进miR-204-5p的表达并抑制Runx2、骨钙素、骨桥蛋白等钙化相关蛋白的表达；而转染pcDNA-TUG1过表达LncRNA TUG1能抑制miR-204-5p的表达，并使Runx2等相关蛋白的含量增加。在高胆固醇诱导ApoE-/-小鼠24周建立主动脉瓣膜钙化模型中，向主动脉瓣膜钙化的ApoE-/-小鼠注入LncRNA TUG1 GapmeR 10使其表达降低，结果显示，miR-204-5p的表达明显升高但Runx2的表达显著降低。由此可见，LncRNA TUG1在主动脉瓣膜间质细胞成骨细胞转化的过程中起着重要调节作用，这可能与miR-204-5p结合从而介导RUNX2的表达密切相关。

2.2 LncRNA MALAT1Zhu等[18]研究发现：BMP-9介导的血管平滑肌细胞成骨细胞分化和钙化与其诱导的Smad2、Smad3和Smad1/5/8磷酸化密切相关，而以上磷酸化的Smad蛋白直接与Smad4结合从而激活靶基因。通过转染Smad4-siRNA沉默Smad4表达可导致ALP活性下降以及钙沉积显著降低，提示Smad4介导的信号通路可能与血管钙化密切相关。Xiao等[19]研究发现：在钙化瓣膜和人主动脉瓣膜间质细胞（VIC）成骨诱导的模型中LncRNA MALAT1表达显著升高。同时，体外实验表明LncRNA MALAT1能抑制miR-204的表达而促进Smad4的活性，促进了主动脉瓣膜间质细胞的成骨分化，该研究还通过细胞转染技术发现Smad4为miR-204的靶蛋白。由此表明：LncRNA MALAT1作为竞争性内源性RNA可通过调节miR-204而促进Smad4的表达，从而充当人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的正调节因子。

2.3 LncRNA H19血管钙化是动脉粥样硬化普遍存在的病理过程，是其重要标志，也是动脉粥样硬化的必然结果[20]。LncRNA H19可通过不同的信号通路与多种肿瘤的发生密切相关。中国人群中LncRNA H19的表达水平与动脉粥样硬化发生的风险和严重程度密切相关[21]。研究发现[22]：动脉粥样硬化患者血清LncRNA H19的表达量明显高于正常健康者，同时与斑块旁组织相比，动脉粥样硬化斑块中的LncRNA H19的表达量也明显升高。该研究通过细胞转染技术过表达LncRNA H19可导致p38和p65上调，而p38和p65分别是MAPK和NF-kB信号通路的关键因子。上述研究提示，LncRNA H19可能激活MAPK和NF-kB信号通路从而促进血管动脉粥样硬化。

2.4 LncRNA-ES3研究报道：MiR-34c作为miR-34家族的成员之一,与细胞向成骨细胞分化、平滑肌细胞钙化、内皮细胞衰老等过程密切相关[23-25]。Xiao等[26]研究发现：在高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化及衰老模型中miR-34c-5p的表达显著降低，将miR-34c-5p模拟物和抑制剂转染入人主动脉血管平滑肌细胞分别过表达及抑制miR-34c-5p的表达。结果显示：当过表达miR-34c-5p时，ALP活性、骨钙蛋白（OC）和Runx2蛋白水平显着降低，而抑制miR-34c-5p时则得到相反的结果。提示miR-34c-5p可抑制细胞钙化。生物信息学分析表明miR-34c-5p和LncRNA ES3之间有些位点存在互补，而3'UTR区域提示Bcl-2修饰因子（BMF）与miR-34c-5p有潜在的结合位点。进一步研究发现，LncRNA-ES3通过直接相互作用抑制miR-34c-5p表达，而miR-34c-5p作用的靶蛋白Bcl-2 修饰因子可促进细胞钙化及衰老。以上研究表明：人主动脉血管平滑肌的钙化及衰老可受LncRNA-ES3/miR-34c-5p/BMF轴调节，LncRNAES3通过直接相互作用抑制miR-34c-5p的表达。通过抑制LncRNA-ES3表达可进一步抑制人主动脉血管平滑肌的钙化及衰老。

3 抑制血管钙化的LncRNAs

3.1 LncRNA HOTAIRLncRNA HOTAIR是一种长2.2kb的非编码RNA，最初被发现调节HOX基因表达[27]。进一步研究发现，HOTAIR可帮助Polycomb抑制复合物2（PRC2）（包含EZH2和SUZ12、三甲基化H3赖氨酸K27）对其靶向基因吸附进而调节目标基因，沉默表观遗传[27-29]。Katrina Carrion等[30]研究发现：人主动脉间质细胞在含胶原蛋白-1包被的Bioflex上生长板（BF-3001C Flexcell International）循环拉伸14%24 h后，LncRNA HOTAIR的表达水平降低，而碱性磷酸酶和骨形态发生蛋白-2的表达明显升高。通过转染siRNA抑制LncRNA HOTAIR表达后碱性磷酸酶和骨形态发生蛋白-2（bmp-2）的表达明显升高。被循环拉伸14% 24 h后的人主动脉间质细胞其WNT/b-CATENIN信号通路被激活。既往研究表明，WNT/b-CATENIN信号通路促进主动脉瓣钙化[31-34]和其他钙化过程[35-39]。用WNT激动剂处理可导致ALPL和BMP2表达增加，而抑制了LncRNA HOTAIR的表达。以上研究表明：在人主动脉瓣膜细胞中长LncRNA HOTAIR被循环拉伸及WNT/b-CATENIN调节，从而抑制细胞钙化。

3.2 LncRNA-ANCR抗分化非编码RNA是一种包含855个碱基的LncRNA。研究发现[40]：LncRNA ANCR在人成骨细胞分化时的表达显著下降，LncRNA ANCR可通过募集增强子zeste homolog 2而抑制Runx2的表达，抑制人成骨细胞的分化。同时用β-GP处理小鼠血管平滑肌细胞后，Runx2和BMP-2的表达量明显升高，而LncRNA ANCR表达量显著降低[41]。构建LncRNA ANCR过表达慢病毒载体并感染小鼠VSMCs，显示LncRNA ANCR过表达显著抑制了β-GP诱导Runx2和BMP-2的升高，同时钙化结节也明显降低。进一步研究发现，LncRNA ANCR过表达可抑制NF-KB信号通路从而减弱动脉钙化。以上研究表明：LncRNA ANCR在β-GP诱导的小鼠VSMCs成骨分化中起到抑制作用，这与减弱NFKB信号通路密切相关。提示LncRNA ANCR可能是动脉钙化中的关键性负性调节因子。

3.3 LncRNA GAS5以往研究发现[42-45]：TGF-β能促进血管平滑肌细胞的成骨样分化，这与激活TGF-β/Smad3信号通路密切相关，SM22α作为血管平滑肌标志物在血管平滑肌细胞表型转化过程中扮演了重要角色。LncRNA GAS5能结合Smad3蛋白，并通过其rSBE元件抑制Smad3的转录活性，从而抑制TGF-β诱导的血管平滑肌分化，通过细胞转染过表达Smad3蛋白则可逆转该过程[46]。上述研究表明：LncRNA GAS5在血管平滑肌细胞表型转化和成骨分化过程中可能起到重要的抑制作用。

4 LincRNA ENST00000540293

二肽基肽4（DPP4）是766个氨基酸组成的高度糖基化的Ⅱ型跨膜蛋白，属于丝氨酸蛋白酶家族，它的其中一种催化底物即为肠促胰岛素。LincRNA ENST00000540293是一种位于11号染色体并包含1000个碱基的基因间LncRNA，目前尚无关于LincRNA ENST00000540293的文献报道。既往研究表明：DPP4不仅在降低血糖中起到重要作用，在其他方面也有独特功能[47]。同时DPP4在多种组织上广泛表达，如内皮细胞和免疫细胞，发挥着重要的调节作用[48]。我们前期实验证明DPP4能通过激活ERK/NF-Kβ通路促进人血管平滑肌细胞的钙化，并通过基因芯片筛查与DPP4促进人血管平滑肌细胞钙化相关的LncRNAs，芯片结果提示基因间LncRNA ENST00000540293（LincRNA ENST00000540293）在DPP4干预后表达显著降低[49,50]。为进一步分析LincRNA ENST00000540293是否与人血管平滑肌钙化（HVSMCs）相关，构建沉默LincRNA ENST00000540293的转染体并感染人HVSMCs，结果显示沉默LincRNA ENST00000540293表达后，钙化相关蛋白表达显著增加，如骨形成蛋白-2 （BMP-2）、骨保护素（OPG）。同时通过茜素红染色提示LincRNA ENST00000540293沉默后有明显钙化结节形成[50]。以上研究表明：LincRNA ENST00000540293是DPP4促进人血管平滑肌钙化潜在负性调节因子，过表达LincRNA ENST00000540293可能会抑制人血管平滑肌钙化。

5 展望

血管钙化是一个主动的、复杂可调的生物学过程，而动脉粥样硬化等慢性血管钙化疾病对中老年人健康和生活造成了很大的影响。越来越多的LncRNA被证实在调控血管平滑肌成骨分化过程中扮演着重要角色，如：LncRNA TUG1，LncRNA MALAT1，LncRNA H19，lncRNA-ES3等均可能与血管平滑肌的成骨分化正相关；而LncRNA HOTAIR，LncRNA-ANCR，LncRNA GAS5，LincRNA ENST00000540293等可能与血管平滑肌的成骨分化负相关。然而, 对于哺乳动物的LncRNA及其调控机制的认识仍存在不足, 包括LncRNA的数量及它们的作用机制。LncRNA作为近年的研究热点，进一步研究LncRNA在血管钙化过程中的调控作用，可为血管钙化诊疗提供新的方向。