外泌体——卵巢癌诊治潜在新靶点

应 翔，冯杏君，郑灵芝

(浙江省台州医院妇产科，浙江 台州 317000)

卵巢癌起病隐匿，病程进展较快，对女性健康造成严重的威胁。卵巢癌的病死率位居妇科恶性肿瘤的首位[1]。大部分卵巢癌患者确诊时已处于病程中晚期，且常伴有转移[1]；在有效手术和以顺铂为基础的联合化疗下，肿瘤细胞较易发生化疗耐药，导致复发率较高。因此，深入探索肿瘤进展和转移机制，对于卵巢癌的早期诊断、开展新治疗策略以及提高远期生存率具有重要意义。

外泌体是直径为30～100 nm的超微膜性囊泡，具有脂质双分子层结构，近年来成为学者关注的热点。研究表明，肿瘤细胞、免疫细胞、红细胞、血小板等几乎所有类型的细胞都可释放外泌体，外泌体内携带蛋白质、核酸、脂类等多种生物活性分子，在细胞间通信作用中发挥重要作用[2]。在肿瘤微环境中，外泌体通过调控肿瘤细胞生物学行为、血管生成、免疫耐受、肿瘤耐药、转移前环境形成等促进肿瘤进展及转移[3-4]。此外，外泌体还可存在于血浆、唾液、尿液、乳汁、脑脊液、腹水等体液，正常人群和卵巢癌患者的外泌体数量及内容物组成和含量均存在差异，可能成为疾病早期诊断的新的生物标志物[5]。现就外泌体及其在卵巢癌早期诊断方面的研究进展予以综述。

1 外泌体概述

1.1外泌体结构 外泌体是细胞膜内陷形成的微小囊泡，于1981年在绵羊网织红细胞中被首次发现，其形成过程主要包括细胞膜周围早期核内体的形成以及细胞核周围晚期核内体的发育成熟[6]。含有腔内囊泡的成熟晚期核内体，称多泡体。多泡体可与溶酶体融合，通过水解降解其内容物，还可与细胞膜融合，将其腔内囊泡释放到细胞外环境，即外泌体。免疫细胞、肿瘤细胞等多种细胞在正常和病理条件下均可分泌外泌体[3]。与正常细胞相比，肿瘤细胞在高压、低氧的肿瘤微环境中可产生更多数量的外泌体[7]。

根据母细胞的类型和所处的微环境，外泌体内富含不同类型的蛋白质、核酸和脂质。研究发现，外泌体内含有参与抗原递呈的主要组织相容性复合体Ⅰ和主要组织相容性复合体Ⅱ以及跨膜蛋白、膜联蛋白等多种生物活性蛋白。此外，外泌体中包含DNA、非编码RNA等核酸，通过调节基因表达和蛋白质翻译，在肿瘤发生发展以及疾病诊断中起重要作用[8]。外泌体的释放依赖于H+/Na+和Na+/Ca2+等离子通道的参与，具有时间依赖性，并受到细胞外外泌体的反馈调节。

外泌体与靶细胞作用方式主要有：①与靶细胞直接融合，释放内容物至靶细胞中；②被靶细胞内化，其内容物被靶细胞摄取；③与靶细胞表面特异性蛋白结合[9]。肿瘤细胞通过释放富含蛋白、核酸等生物学活性的外泌体促进肿瘤转移、形成适合肿瘤转移部位的微环境、帮助肿瘤逃避免疫系统监视等。

1.2外泌体的分离与鉴定 血清和体液中外泌体数量和内容物反映了释放外泌体母细胞的生物学特性及刺激母细胞释放的激活剂，故可通过对外周血或体液外泌体的分离及分析来评估和监测肿瘤患者病情。目前，常用的外泌体分离方法是将不含外泌体的胎牛血清培养细胞的上清进行差异超速离心，转速尚无统一标准，大部分研究采用(100 000～180 000)×g，离心30～60 min；随后，根据细胞外液中外泌体处于低密度的特性将其与蛋白复合体等无膜囊泡分离。目前对外泌体的鉴定主要通过形态学观察和蛋白分析的方法，透射电子显微镜可观察外泌体的形态和大小。有学者报道了一个分析透射电子显微镜图像中外泌体形态特征的新软件[10]。流式细胞术是目前外泌体研究最常用的方法，可同时检测外泌体表面的多种抗原，并进行定量。此外，纳米颗粒追踪分析可测量卵巢癌细胞外泌体的大小及其表面蛋白的表达[11]，但适当的外泌体分离检测手段尚有待进一步探索。

2 外泌体与卵巢癌

2.1外泌体通过不同机制促进卵巢癌发生进展 肿瘤微环境由肿瘤细胞、基质细胞及细胞外基质构成，在肿瘤进展转移中起重要作用。外泌体通过传递内容物至邻近细胞发挥生理功能，从而建立适宜肿瘤生长转移的局部微环境[12]。

外泌体通过调节肿瘤细胞生物学行为促进卵巢癌进展。Zhou等[13]发现，卵巢癌患者尿液外泌体高表达微RNA(microRNA，miRNA/miR)-30a-5p，敲除miR-30a-5p基因可显著抑制卵巢癌细胞的增殖迁移能力。Enriquez等[14]研究认为，卵巢癌细胞外泌体高表达RNA结合蛋白——重组人RNA结合蛋白28，促进上皮间质化转变等过程。Kobayashi等[15]研究报道，卵巢癌细胞的侵袭能力与外泌体中let-7 和miR-200家族的富集密切相关。可见，外泌体可调节肿瘤细胞生物学行为，促进肿瘤的发生发展。

上皮-间充质转化指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。腹膜转移是卵巢癌最主要的转移方式。卵巢癌细胞间失去细胞间接触，引起上皮-间充质转化，发生上皮-间充质转化的癌细胞获得较强的迁徙侵袭能力，进而原发灶癌细胞脱落穿透腹膜引起癌细胞的腹腔内播散。有研究发现，肿瘤微环境中的肿瘤细胞及基质细胞可通过传递外泌体内容物诱导肿瘤细胞的上皮-间充质转化，在肿瘤的腹膜转移中发挥重要作用[16]。

新生血管的形成在肿瘤进展及转移过程中起重要作用。Yi等[17]研究发现，与低级别卵巢癌相比，高级别卵巢癌来源外泌体中富含活化转录因子2和肿瘤转移相关蛋白1等，促进血管生成和肿瘤进展。有文献报道，表达CD147(EMMPRIN)的卵巢癌细胞囊泡活化内皮细胞(HUVEC)，促进新生血管的生成[18]。卵巢癌外泌体内富含的可溶性上皮钙黏素，促进新生血管形成，与卵巢癌患者恶性腹水形成及腹膜种植转移相关[19]。由此可见，肿瘤来源的外泌体在新生血管形成中发挥重要作用。

肿瘤的发生和转移与肿瘤细胞所处的局部环境密切相关。外泌体介导的肿瘤细胞及其微环境间的相互作用对肿瘤进展十分重要。侵袭性卵巢癌细胞系及卵巢癌患者体液分离的外泌体携带膜型基质金属蛋白酶1参与细胞外基质降解，促进肿瘤进展[20]。Nakamura等[21]报道，卵巢癌细胞通过外泌体传递分化抗原44 (CD44)至间皮细胞，引起基质金属蛋白酶9分泌增加，形成促进卵巢癌进展的转移龛，从而建立了外泌体促使适合卵巢癌进展转移的肿瘤微环境。

肿瘤细胞释放的外泌体可抑制患者免疫系统，并协助形成肿瘤转移前小灶。卵巢癌细胞通过外泌体诱导单核巨噬细胞分化为肿瘤相关巨噬细胞，抑制其吞噬功能，进而促进肿瘤转移。M2型巨噬细胞由转化生长因子-β、白细胞介素-4等诱导产生，具有抑制免疫应答、促进肿瘤生长转移的生物学作用。肿瘤相关巨噬细胞大多表现为M2型。研究发现，卵巢癌细胞外泌体来源的miR-222-3p可诱导巨噬细胞分化极化为M2型肿瘤相关巨噬细胞，促进肿瘤进展[4]。卵巢癌外泌体可降低自然杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤毒性[22]。可见，肿瘤来源的外泌体可通过调节微环境中的免疫细胞减弱免疫应答，从而协助卵巢癌细胞逃避免疫攻击。

2.2外泌体在卵巢癌早期诊断及治疗监测中的价值 卵巢癌往往起病隐匿，且预后较差，早期筛查诊断和治疗是降低肿瘤死亡率的有效途径。血清糖类抗原125和人附睾上皮分泌蛋白4的表达水平是目前最常用的卵巢癌早期诊断指标之一，但两者在卵巢癌筛查中的敏感性和特异性均欠佳，需进一步寻找新的敏感性和可靠性较高的早期诊断标志物。外泌体在卵巢癌患者血清和腹水中广泛存在，其在疾病诊断中的应用逐渐受到关注。miRNA指约由22个核苷酸组成的非编码单链RNA，其表达水平失衡可能导致疾病发生。肿瘤细胞可释放外泌体进入外周血，包裹在外泌体中的miRNA受到囊泡的保护，故其稳定性较高。Ying等[4]研究发现，与健康女性相比，卵巢癌患者血清外泌体miR-222-3p表达水平较高。一项队列研究表明，与早期卵巢癌(国际妇产科联盟分期Ⅰ～Ⅱ期)相比，中晚期卵巢癌(国际妇产科联盟分期Ⅲ～Ⅳ期)患者外周血外泌体miR-200b和miR-200c表达水平较高[23]。随着卵巢癌病程的进展，很多患者表现为恶性腹水，血清外泌体中的miRNA谱作为一种无创检查，可能成为卵巢癌早期筛查与诊断的新的生物标志物。

卵巢癌细胞外泌体内富含生物活性蛋白分子。与正常对照组相比，卵巢癌患者外泌体高表达上皮细胞黏附分子[24]。黏附分子24(CD24)与卵巢癌预后相关，卵巢癌患者腹水外泌体高表达CD24[25]。与早期卵巢癌患者相比，进展期卵巢癌患者腹水中外泌体数量更多，且外泌体中基质金属蛋白酶2表达水平升高[26]。可见，外泌体内蛋白表达水平可能成为新的诊断卵巢癌的标志。此外，探索特异度和灵敏度较高的外泌体检测方法对外泌体的临床应用非常重要。

除作为肿瘤早期检查指标外，外泌体还可通过参与肿瘤细胞药物代谢过程影响肿瘤细胞的耐药性。有研究发现，外泌体可提高上皮性卵巢癌对顺铂类药物的耐药性[27]。铂类耐药的卵巢癌细胞外泌体可提高非铂类耐药卵巢癌细胞的耐药性。卵巢癌细胞中，对紫杉醇耐药的肿瘤细胞较紫杉醇敏感细胞更容易释放富含P-糖蛋白的外泌体。富含P-蛋白的外泌体可通过调节局部肿瘤微环境提高肿瘤细胞对阿霉素和紫杉醇的耐药性[28]。因此，在卵巢癌患者耐药性筛选生物新标记的开发中，外泌体具有较好的应用前景。

2.3外泌体与卵巢癌治疗 目前，手术治疗和以顺铂为基础的联合化疗是卵巢癌的一线治疗，但由于肿瘤细胞易对化疗药物产生耐药，故卵巢癌的复发率较高，且分子靶向治疗和免疫治疗仍无法提高卵巢癌患者的5年生存率。

以RNA干扰为基础的基因治疗是基于小干扰RNA引起转录后水平的基因沉默技术，目前有研究致力于将其应用于恶性肿瘤的治疗。外泌体在人体体液循环中稳定存在，且不引起免疫排斥，其作为递送药物的载体可提高抗肿瘤治疗的成功率[29]。外泌体可保护RNA分子免受RNA酶、温度等的影响。Reza等[30]研究发现，脂肪间充质干细胞外泌体可通过传递miRNA抑制卵巢癌细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡。外泌体可传递花青素，故花青素可提高卵巢癌的治疗效果[31]。加载雷公藤的外泌体可抑制卵巢癌细胞的增殖以及肿瘤的生长，具有较好的肿瘤治疗潜力[32]。综上所述，外泌体可作为载体用于治疗转移性或复发性卵巢癌，但目前此研究尚处于起步阶段，仍有待进一步的临床研究。

肿瘤免疫治疗是较新的肿瘤治疗手段。外泌体具有调节免疫的生物学特性，故有望应用于肿瘤免疫治疗。树突状细胞可通过活化T细胞杀灭肿瘤细胞，研究发现，树突状细胞来源的外泌体可通过激活 T细胞和自然杀伤细胞增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。目前，树突状细胞外泌体治疗部分晚期恶性肿瘤正处于临床试验阶段[33]。

外泌体在卵巢癌免疫治疗中具有较好的应用潜力，但目前尚无以外泌体为基础的卵巢癌免疫治疗研究的相关报道。某些类型的多肽物(如整合素结合肽)可通过结合卵巢癌来源的外泌体膜抑制受体细胞摄取外泌体[34]。外泌体的大小影响其在细胞间信息传递的速度，为其在治疗领域的应用提供了新的思路，外泌体有望成为卵巢癌免疫治疗及靶向治疗的有效靶点。

3 小 结

在妇科肿瘤中，卵巢癌的病死率最高，其发病机制未明。近年来，随着对外泌体研究的不断深入，外泌体的许多未知功能逐渐被发现。揭示外泌体在卵巢癌发生发展中的作用为开发卵巢癌诊断标志物以及开辟其治疗新策略提供了新的思路。外泌体内含有丰富的核酸、蛋白等生物活性分子，并广泛存在于卵巢癌患者腹水及外周血循环中，对卵巢癌的早期诊断具有重要意义。在治疗方面，外泌体的研究主要集中于调节外泌体的释放、将外泌体作为载体进行药物传递、以外泌体为靶点介导肿瘤靶向治疗、基于外泌体的肿瘤免疫治疗等方面。目前关于外泌体的大部分研究仍处于体外实验或动物实验阶段，对其在人体内表达及调控的研究较少。因此，外泌体与卵巢癌形成和进展关系及其在肿瘤诊治的应用有待进一步探究。