嵌合抗原受体T细胞的研究进展

冯淑娴，王 歌

(1.联勤保障部队第940医院安宁分院妇产科，兰州 730070； 2.中南大学湘雅医学院临床医疗系，长沙 410083)

目前，免疫治疗是肿瘤治疗的有效手段。T淋巴细胞具有极强的肿瘤细胞杀伤作用[1]。近年来，随着肿瘤免疫学的发展，肿瘤治疗中基因改造T细胞的发展迅速。单链抗体技术与T细胞活化基序结合应用的免疫治疗技术可精确靶向并持久杀伤肿瘤细胞、改变肿瘤免疫抑制微环境、破坏宿主免疫耐受状态，并可为过继性细胞免疫治疗提供新的有效解决方案，成为肿瘤免疫治疗的有效方法。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)-T细胞是目前临床免疫治疗的主要细胞。CAR-T细胞可有效消除肿瘤干细胞亚群及其他肿瘤细胞，在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤等恶性肿瘤治疗中均显示出良好的抗肿瘤效应[2-4]。CAR-T细胞的临床应用广泛，但仍存在很多风险，在临床治疗中，准确找到肿瘤特异性靶点、改善免疫抑制微环境、有效控制CAR-T细胞成为目前肿瘤免疫治疗的首要目标。现就近年来CAR-T细胞的研究进展予以综述。

1 CAR-T细胞的结构

CAR的胞外配体结合域由单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)组成，可通过跨膜区与胞内信号域连接[5]。CAR技术的基本原理是将scFv与T细胞的胞内区序列拼接，再通过逆转录病毒或慢病毒载体、DNA转座子、电穿孔等技术进行基因编辑。基于RNA[CRISRP(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/caspase-9]及蛋白质(锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶)的基因编辑技术可有效敲除抑制性基因或诱导CAR-T细胞功能增强分子的表达。CAR与肿瘤相关抗原结合可活化CAR-T细胞，表现为CAR依赖的杀伤、增殖及细胞因子释放。

CAR的结构一共经历了四代发展[6]。第一代CAR将scFv与免疫球蛋白Fc受体的γ链或CD3复合体的ζ链融合，形成CAR-T细胞受体。第一代CAR-T细胞无共刺激分子，在体内存活时间较短，将协同刺激因子与CAR融合可活化共刺激分子和胞内信号域，增强T细胞功能。二代CAR-T细胞可在CD3结构域的上游融合1个协同刺激因子(如CD27、CD28、OX40、ICOS、4-1BB等)，三代CAR-T细胞的胞内区域可融合多个协同刺激因子。三代CAR-T细胞活化、增殖、分泌细胞因子和细胞毒素的作用更强，对三代CAR-T细胞亲和力较低的分子也可促使三代CAR-T细胞的活化，但效果尚不确定。四代CAR-T细胞(也称为TRUCK细胞)还可诱导转基因产物的表达，如分泌细胞因子调节CAR-T细胞及机体免疫细胞的功能[7]。

2 影响CAR-T细胞治疗效果的因素及解决方法

2.1脱靶效应 许多肿瘤抗原不仅在癌细胞高表达，还可在正常组织少量表达，增加了发生免疫治疗脱靶杀死正常细胞的可能性，并可能发生交叉反应而靶向抗原结构相似的其他组织。设计串联性CAR是提高特异性的方法之一，串联性CAR由两个串联的靶向不同抗原的scFv组成，只有同时结合两种抗原才能活化T细胞[8]。此外，还可通过T细胞共刺激或共抑制受体识别T细胞组合信号改善治疗效果的自主控制，减少脱靶效应。

与门逻辑设计的双抗原CAR-T细胞可表达携带CD3ζ链以及携带共刺激基序的两种CAR，只有两种CAR同时表达T细胞才能被完全激活并增殖[9]。与此相反，以非门逻辑设计的抑制性CAR是利用共抑制受体程序性细胞死亡受体-1或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4的抑制性信号转导链取代CAR胞质尾部的刺激性信号转导结构域。当抑制性CAR与同时表达CAR和抑制性CAR抗原的细胞结合时，T细胞活性被抑制[10]。此方法需要进一步鉴定潜在脱靶组织的特异性抗原，以确定抑制性CAR的靶向抑制性抗原。

或门逻辑在CAR-T细胞识别肿瘤抗原中也具有重要作用。在肿瘤免疫编辑过程中，肿瘤细胞可通过抑制特异性抗原的表达实现免疫逃逸，或门逻辑设计的CAR可靶向B细胞CD19和CD20抗原，使缺失CD19的CAR仍具有抗肿瘤作用[11]。

有研究开发了synNotch(synthetic Notch)受体[12]。Notch蛋白为跨膜受体，其胞内结构域含有转录调节因子，当Notch蛋白与关联的细胞外配体结合并诱导膜内蛋白水解后，该转录调节因子被切割释放。synNotch受体保留了Notch受体中控制配体依赖性切割及胞质尾释放的最小跨膜核心结构域，而其配体结合结构域和胞质结构域分别由scFvs和转录调节因子(如Gal4-VP64或tetR-VP64)取代。synNotch受体技术作为与门识别的新方法，通过激活配体诱导CAR的表达，并调节细胞杀伤作用。因此，在局部肿瘤微环境中，synNotch受体与抗原结合前的T细胞无细胞毒性成为识别抗原的更安全选择。

细胞内肿瘤标志物一般不作为抗原，但其特异性较细胞外抗原更强。细胞内抗原通过主要组织相容性复合体Ⅰ在肿瘤细胞表面表达，T细胞受体具有识别细胞内抗原的能力，但T细胞受体的固有低亲和性以及肿瘤细胞表面低密度的主要组织相容性复合体分子限制了T细胞受体的临床应用。与低亲和力T细胞受体相比，T细胞受体样抗体不仅保留了T细胞受体的特异性，还具有高亲和性。研究发现，多种T细胞受体样抗体可靶向肿瘤及病原体衍生的多种主要组织相容性复合体Ⅰ肽复合体[13]。目前，已经研发出具有亲和力的肾母细胞瘤抗原1(由人类白细胞抗原A2呈递)人抗体[14]。在构建CAR时结合高亲和力T细胞受体样抗体，并将细胞内标志物作为潜在靶标，可提高CAR-T细胞免疫治疗的特异性及安全性，但其对脱靶效应的识别潜力仍有待验证。

2.2细胞控制 细胞控制是CAR-T细胞疗法需要解决的主要难题之一。T细胞和其他免疫细胞均可导致细胞因子风暴，严重损害机体健康，因此基本细胞控制对细胞免疫治疗的成败十分重要。将自杀基因导入CAR-T细胞是控制细胞治疗效果的方法之一。自杀基因指某些病毒或细菌中具有催化无毒药物前体，并使其转变为细胞毒物质的酶的基因。将自杀基因导入靶细胞可导致携带该基因的受体细胞死亡，如单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷自杀基因系统,胸苷激酶可催化丙氧鸟苷生成有细胞毒性的核苷酸，阻止DNA合成，进而导致细胞死亡[3]。在肿瘤细胞内表达的自杀基因可将无毒性前体药物转化为高毒性代谢产物，以杀伤肿瘤细胞，但其具有以下缺点：①病毒蛋白有免疫原性；②有效的DNA整合才能使肿瘤细胞的消除生效；③ T细胞清除需要的时间较长；④在单纯疱疹病毒胸苷激酶基因中存在耐药突变。

通过修饰免疫细胞信号传递通路是控制CAR-T细胞治疗的另一方法。研究表明，icaspase-9包含一个FKBP12-F36V药物结合域和一个caspase-9胞内段。FK506类似物(AP1903/AP20187)可诱导FKBP12-F36V的二聚化，激活caspase-9和凋亡通路，迅速驱动T细胞凋亡[15]。此外，通过敲除人表皮生长因子受体胞外结构域Ⅰ、Ⅱ及其胞内结构域并保留含有西妥昔单抗结合位点，可产生截短的人表皮生长因子受体，可见西妥昔单抗驱动的细胞毒性作用可清除表达CAR和截短的人表皮生长因子受体的T细胞[16]。但通过清除T细胞控制肿瘤发展的治疗效果存在一定局限性：①若CAR-T治疗造成患者损伤，即使清除99%的CAR-T细胞也无法完全抑制细胞的毒性作用；②若T细胞对药物不敏感，即机体不表达相应受体，则无法清除肿瘤细胞；③患者体内CAR-T细胞清除后，可能导致治疗终止或失败。

调节T细胞的转导激活信号能力是控制细胞活性的另一种方式，可通过将受体的配体结合域与胞质信号转导链分开来实现，即“ON-switch CAR”，抗原和二聚化药物同时存在才可激活，改变药物浓度可有效调节CAR-T细胞的杀伤力和增殖活性[17]。与自杀基因控制相比，调节T细胞的转导激活信号可更有效地控制治疗性T细胞，但受到固定表达CAR的限制。小分子适配器可控制T细胞活性，如构建结合Fc结构的CD16V-BB-ζ抗体。小分子适配器无抗肿瘤作用，在体内与Fc结合后可促使T细胞激活，未经适配器刺激的细胞会“沉默”，不识别和靶向任何细胞。研究发现，含有异硫氰酸荧光素[18]或抗多肽新抗原表位[19]的肿瘤抗原特异性抗体适配器分子可以剂量滴定方式控制CAR-T细胞的活性、组织浸润、细胞因子释放和表型。通过使用不同的适配器分子可使CAR-T细胞靶向不同抗原，并通过构建细胞因子受体控制T细胞功能。

2.3免疫抑制微环境 肿瘤与免疫系统的相互作用是长期的动态变化过程，肿瘤发生伴随免疫监视、免疫平衡、免疫逃逸3个阶段，最终建立肿瘤免疫抑制微环境。免疫抑制微环境可影响CAR-T细胞的活性，抑制其抗肿瘤作用，改变肿瘤免疫抑制微环境对提高CAR-T细胞的疗效十分重要。

解除免疫检查点对T细胞的抑制作用是改变免疫抑制微环境的有效措施之一，如将程序性细胞死亡受体-1跨膜和胞质尾部替换为共刺激域，在结合检查点分子后可促进细胞的激活或使用程序性细胞死亡受体-1/程序性细胞死亡配体1抗体。目前，一些实验致力于通过CRISPR/caspase-9技术[23]使T细胞不表达程序性细胞死亡受体-1。此外，使用CRISPR/caspase-9进行异体基因敲除而产生的通用CAR-T细胞，有可能改善目前CAR-T细胞的疗效。

细胞因子在肿瘤发展与免疫活动中有重要作用，通过T细胞修饰可使T细胞表达细胞因子受体基因或细胞因子基因，有助于改善免疫抑制微环境。有实验显示，IL-7在体外和体内均支持IL-7Rα、GD2特异性CAR、EB病毒特异性T细胞的增殖和抗肿瘤活性，且存在全功能调节性T细胞时也是如此[24]。另有实验发现，表达IL-4胞外区的T细胞可被肿瘤产生的抑制性细胞因子IL-4激活，且仅在肿瘤微环境中发生，避免了CAR-T细胞对正常组织造成损伤[25]。IL-15可促进T细胞的增殖和存活，激活人记忆CD8+T细胞的端粒酶活性[26]，并在T细胞表达时，促进干细胞记忆表型[27]。

另外，赋予CAR-T细胞主动重构肿瘤微环境的能力，如使CAR-T细胞表达炎症因子IL-12、IL-2、IL-15等均显示T细胞在肿瘤抑制性微环境中能力增强。实验发现，通过基因修饰可使CD19的CAR-T细胞表达单纯疱疹病毒受体，其与配体结合后可改善免疫抑制微环境[28]。synNotch受体是诱导刺激性细胞因子、趋化因子、抗体(包括检查点抑制剂)、双特异性抗体和先天性免疫刺激分子等表达的有效载体[29]。因此，可以通过synNotch受体设计CAR-T细胞，以增强CAR-T细胞识别肿瘤和重构肿瘤微环境的能力。

2.4CAR-T细胞的浸润 与血液肿瘤相比，CAR-T细胞在实体肿瘤中的浸润更困难，这可能是CAR-T细胞对实体肿瘤治疗效果不佳和易复发的原因。不同给药途径在CAR-T细胞实体肿瘤浸润中所起的作用不同，如采用胸腔内注射的抗间皮素CAR-T细胞的抗肿瘤疗效优于全身使用[30]。另一方面，CAR-T细胞可主动改变肿瘤微环境，提高CAR-T细胞的浸润。研究发现，体外扩增的T细胞可下调乙酰肝素酶信使RNA的表达，使T细胞降解细胞外基质中硫酸乙酰肝素蛋白多糖的能力降低。通过T细胞表达乙酰肝素酶可使输注的T细胞更好地降解实体肿瘤细胞外基质，提高其浸润能力[31]。此外，CAR-T细胞表达趋化因子受体还可增强肿瘤浸润。研究表明，BLT1和CXCR3通过促进CD8+T细胞向肿瘤细胞的迁移来调节抗肿瘤免疫[32]。除响应天然配体外，研究还设计了能向生物惰性小分子定向迁移的T细胞[33]。通过对表达G蛋白偶联受体T细胞的基因修饰，促使T细胞向生物惰性小分子氯氮平-N-氧化物迁移，此模式中，受体不响应天然配体，惰性药物不结合天然细胞，T细胞的靶向能力得到提高。

3 结 语

CAR-T细胞免疫疗法作为免疫治疗的新技术已成功应用于血液肿瘤治疗，为实体肿瘤患者的治疗带来新希望。然而，CAR-T免疫疗法在实体肿瘤的应用还面临诸多困难。实体肿瘤的异质性决定了其治疗必须与细胞本身的特点、作用规律等因素相结合。目前，研究人员正试图通过多方面的探索寻找更多的肿瘤抗原，以提高靶点的特异性或选择多个靶点进行治疗；通过进一步对T细胞进行修饰，促进CAR-T细胞向肿瘤组织的迁移浸润，解除肿瘤微环境的免疫抑制性，最终提高CAR-T细胞在实体肿瘤中的抗肿瘤效果。随着合成生物学和基因组工程的不断发展，模块化基因编码工具的开发将推动CAR-T细胞治疗的不断完善，从而促进肿瘤精准细胞免疫治疗的发展。