Nrf2-ARE通路与肿瘤耐药的研究进展

康 意，张 静，王晓玲，汪 涛

(天津中医药大学，天津 300193)

随着饮食结构变化、环境污染加重、人口老龄化趋势加速，恶性肿瘤的发病率在全球呈上升趋势。据2013年统计，世界人口标准化恶性肿瘤发病率为186.15/10万，中国人口标准化恶性肿瘤发病率为190.17/10万[1]。目前治疗恶性肿瘤的手段包括化疗药物控制、放疗、免疫治疗等，其中药物治疗有不可替代的作用，利用化疗药物诱导肿瘤细胞死亡和(或)抑制肿瘤细胞存活是癌症治疗的主要原则。但是大剂量化疗药物的毒副作用及药物的多耐药性(multidrug resistance，MDR)已成为临床治疗肿瘤的瓶颈，也是临床肿瘤化疗失败的主要原因，因此探究有效预测肿瘤化疗敏感性的分子标志物以及多药耐药逆转的分子靶点是恶性肿瘤治疗研究的重点[2]。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性已成为肿瘤研究迫切需要解决的问题，参与细胞抗氧化应激反应的核转录相关因子2-抗氧化反应元件(nuclear factor erythroid-2 related factor 2-antioxidant response element，Nrf2-ARE)通路在肿瘤细胞MDR的产生中发挥关键作用。Nrf2-ARE通路能通过Keap1、Nrf2等信号节点基因的突变影响Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶系及药物转运体等蛋白的表达和(或)与肿瘤细胞自噬的交互作用参与肿瘤细胞MDR的每个环节。针对Nrf2-ARE通路开展肿瘤细胞MDR的研究有重要意义。现就Nrf2-ARE通路与肿瘤耐药的研究进展进行综述。

1 Nrf2-ARE通路及其调控机制

Nrf2-ARE通路是细胞抗氧化应激反应的中枢调控点，是细胞抵抗各种环境及内源性应激机制中必不可少的部分。在细胞遭受氧化损伤后，激活Nrf2可诱导ARE依赖性的多种解毒酶和抗氧化防御蛋白表达，以增强细胞降解或清除有害物质的能力，在抗肿瘤、抗炎症及抗应激反应等方面发挥广泛的细胞保护作用。Nrf2-ARE通路已成为肿瘤化疗作用的靶点，但Nrf2在肿瘤细胞中过度激活也与肿瘤的演进及肿瘤化疗耐药有关。Nrf2-ARE通路主要有两种基本的激活途径：经典通路是指Nrf2在与其负调控蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch like ECH associated protein 1，Keap1)的非活性复合物解离后，入核易位发挥核转录因子作用的过程，这是Nrf2激活的主要机制；非典型通路是指许多蛋白通过与Nrf2竞争结合Keap1，稳定核内Nrf2的量，参与此通路的激活[3-8]。

1.1Nrf2-ARE通路经典激活途径 细胞内Nrf2含量和功能主要受Keap1分子调控。Keap1是与胞质肌动蛋白结合的一种多肽，分子量为69 000，在转录后水平对Nrf2的活性进行负向调节[3]。核转录因子Nrf2是一种帽和领家族成员，分子量为 66 000，分子C端含有一个高度保守的碱性亮氨酸拉链结构，该结构有助于其形成异源二聚体与细胞DNA上的ARE元件结合。在正常生理状态下，Nrf2被Keap1锚定在肌动蛋白细胞骨架上滞留于细胞质，作为Cul3-E3泛素蛋白酶体底物，经泛素化降解，核中仅有少量的Nrf2发挥维持基本转录水平的作用。当细胞遭受氧化应激或在化学亲电子试剂作用后，由于Cul3-E3泛素蛋白酶失活或Nrf2与Keap1解离，不能被泛素化降解的Nrf2大量入核，与ARE序列结合，启动受ARE调控的一系列内源性抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶及药物转运泵等相关基因的表达，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、血红素氧化酶1、醌氧化还原酶1、谷胱甘肽S转移酶及多药耐药蛋白等[4-6]。

1.2Nrf2-ARE通路非经典激活途径 研究表明，Nrf2-ARE通路也可通过不同的蛋白激酶磷酸化Nrf2被激活。促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等蛋白激酶均能直接磷酸化Nrf2，使其从Keap1复合物上解离，发生核易位来调控ARE下游靶基因的表达，进而活化Nrf2-ARE通路[7]。此外，自噬相关蛋白p62亦能通过激活Nrf2-ARE通路参与细胞抗氧化应激反应。p62蛋白中Keap1作用区(Keap1-interacting region,KIR)结构的S351磷酸化后，p62与Keap1亲和力增强，与Nrf2竞争更多地结合于Keap1，并通过自噬途径将Keap1降解，使Nrf2大量入核并在细胞核内稳定累积，激活Nrf2通路[8]。因p62转录增强子上含ARE序列，p62在蛋白质表达水平上也被Nrf2调控，p62与Nrf2-ARE通路形成一个抗氧化反应的正反馈环路[9]。

2 肿瘤细胞的多耐药机制

临床肿瘤化疗失败的主要原因是肿瘤细胞产生MDR，肿瘤细胞不仅对一种抗癌药物产生抗药性，也对其他结构和作用机制不同的抗癌药物产生交叉耐药。肿瘤多耐药机制复杂，涉及多个方面，如肿瘤细胞内药物的浓度降低，药物代谢解毒，DNA损伤修复功能失衡、肿瘤细胞自噬及凋亡异常等。

2.1肿瘤细胞药物转运相关蛋白的异常表达 药物转运相关蛋白能够将细胞内的化学药物外排，降低细胞内药物浓度，减弱药物的细胞作用，使细胞产生耐药性。MDR1基因编码的P-糖蛋白是目前研究最多的多药耐药蛋白之一，属于ATP结合盒转运蛋白超家族成员之一，存在于细胞膜上，是与药泵作用类似的能量依赖性转运蛋白。高表达P-糖蛋白的肿瘤细胞能将不同结构和作用方式的化疗药物排出细胞，降低细胞内化疗药物浓度，致使肿瘤细胞对许多化疗药物的敏感性降低而产生耐药性。研究发现，蛋白激酶抑制剂LY294002能通过减少P-糖蛋白蛋白表达，直接抑制P-糖蛋白功能，使肿瘤细胞内化疗药物的浓度升高，逆转耐药株KB/VCR细胞的多药耐药性[10]。研究发现，短发夹RNA可以有效抑制MDR1信使RNA的转录和P-糖蛋白的表达，使耐药株BIU-87/阿霉素细胞对阿霉素的敏感性增加而产生耐药[11]。研究提示，miR-451能够负向调节P-糖蛋白的信使RNA及蛋白的表达，从而提高卵巢癌细胞A2780的耐药性[12]。

2.2体内化疗药物代谢酶系统的异常表达 与肿瘤耐药相关的体内酶系统有3类：①抗氧化及解毒酶系，如谷胱甘肽/谷胱甘肽S转移酶体系。研究表明，许多肿瘤的耐药细胞内高表达谷胱甘肽/谷胱甘肽S转移酶，使用各种谷胱甘肽系统的抑制剂与谷胱甘肽类似的谷胱甘肽S转移酶前药能有效降低肿瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性。化合物3ATA(3β-acetyl tormentic acid)能通过降低小细胞癌GLC4/阿霉素耐药细胞株内谷胱甘肽的水平，使肿瘤细胞的死亡率明显提高[13]。②Ca2+依赖性蛋白激酶体系，如MAPK、PKC等。研究证实，MAPK通路的多个主要家族成员(胞外信号调节激酶、c-Jun氨基端激酶及p38激酶)的调节剂能通过影响P-糖蛋白的表达或药物转运活性干预肿瘤多药耐药过程[14-16]。PKC广泛分布于各种组织细胞，介导细胞间信号转导并调控多种重要基因的表达，与肿瘤发生和化疗耐药关系密切。PKC参与胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞耐药相关蛋白的合成。PKC系统抑制剂可有效提高化疗药物杀死肿瘤耐药细胞的比例，PKCα的抑制剂Ro-31-7549可增加乳腺癌巨噬细胞趋化因子7/阿霉素耐药细胞株对阿霉素的敏感性，且PKCα的活性与耐药呈正相关[17]。③可催化切断DNA磷酸二酯键的核酶，如拓扑异构酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ，TopoⅡ)。TopoⅡ不仅与恶性肿瘤细胞无限增殖调控机制有关，还参与具有外排功能膜蛋白的合成过程，使肿瘤细胞产生耐药性导致化疗失败。许多化疗药物均以TopoⅡ为重要靶点，通过影响TopoⅡ的功能而产生抗癌作用。抑制人肿瘤细胞TopoⅡ活性可降低耐药株细胞化学抵抗，加速肿瘤细胞凋亡[18]，如在多发性骨髓瘤细胞上敲低TopoⅡ可显著降低肿瘤细胞对化疗药阿霉素的耐药性[19]。

2.3肿瘤细胞DNA损伤的异常修复 临床治疗肿瘤时，常使用的化疗药物如顺铂、阿霉素及5-氟尿嘧啶等均可造成肿瘤细胞DNA损伤，发挥抑制细胞增殖或促进细胞凋亡的作用，但肿瘤细胞DNA反复损伤可诱发DNA修复系统活性异常活跃，导致肿瘤细胞产生化疗耐药。临床研究发现，通过同源重组方式修复DNA双链断裂损伤能使肺癌患者发生顺铂耐药[20-21]。陈递林等[22]通过对比耐药组、化疗敏感组宫颈癌患者术后标本修复交叉互补基因1(excision repair cross complementing 1，ERCC1)的基因表达检测结果发现，与化疗敏感组患者相比，耐药组ERCC1基因核酸以及蛋白水平均明显偏高，ERCC1基因异常表达可能是铂类药物化疗治疗宫颈癌产生耐药的主要因素。试验研究发现，经ERCC1-干扰小RNA转染的肺腺癌细胞对顺铂敏感性升高[23]。

2.4自噬 自噬贯穿于真核细胞生长发育和生理病理过程，是普遍存在的重要生命现象，是细胞为应对不利的微环境压力而被激活的溶酶体降解过程，类似于一种自身适应机制。对于细胞稳态维持机制，自噬是重要的参与者，但对肿瘤细胞，自噬发挥抑制作用还是促进作用尚未有明确定论，许多学者认为自噬具有“双刃剑”效应[24]。在机体处于健康状态下，细胞通过自噬途径来清除已损坏的细胞器，回收可利用的生物大分子，防止细胞恶变，进而预防机体产生肿瘤；但若机体已产生肿瘤，肿瘤细胞能利用自噬途径应对肿瘤生长过程中的营养缺乏、缺氧、缺乏生长因子等代谢压力，或通过自噬清除放化疗时受损的生物大分子或细胞器，使肿瘤细胞耐受放化疗毒性作用，逃避细胞凋亡而生存下来。研究发现，多发性骨髓瘤细胞的Kruppel样因子4能与泛素化连接蛋白p62/SQSTM1(Sequestosome 1)基因的启动子结合，增强多发性骨髓瘤细胞自噬能力，使多发性骨髓瘤细胞对化疗药蛋白酶体抑制剂carfilzomib产生耐药[25]。研究证实某些miRNAs能逆转白血病细胞株的化疗耐药性。miRNAs是一类通过信使RNA转录后调控来影响基因表达的小RNA分子，其中miR-30A可通过调控短发夹RNA模拟或敲低Beclin 1和自噬基因5等自噬基因，下调自噬基因的表达，抑制伊马替尼诱导的自噬，逆转慢性粒细胞白血病细胞耐药性产生[26]。

2.5细胞凋亡通路阻断 细胞凋亡是一种程序化的细胞死亡形式，其结果是有序而有效地移除体内受损的组织细胞。细胞凋亡改变不仅影响肿瘤的发生发展，也是肿瘤细胞产生耐药性的重要原因之一。目前用于临床治疗的大多数抗癌药都是通过调控凋亡途径来诱发癌细胞死亡，但在治疗过程中由于某些原因肿瘤细胞凋亡受到抑制，造成肿瘤细胞化疗耐药。肿瘤多耐药机制与细胞凋亡的两种核心途径均有关，即外源性死亡受体途径和内源性死亡受体途径。细胞凋亡途径由多种调节和执行元件构成，是精细而复杂的网络调控系统，任何凋亡相关蛋白表达异常或功能缺陷均可导致肿瘤细胞凋亡抵抗，进而产生化疗耐药，促凋亡因子和抑制凋亡因子的稳态维持在肿瘤耐药过程中起重要作用。针对骨肉瘤的敏感细胞株和耐药细胞株进行Bcl-2基因的含量测定，发现敏感细胞株中Bcl-2的含量远低于耐药细胞株[27]。利用RNA干扰技术下调鼻咽癌细胞株CNE1抗凋亡蛋白Bcl-2基因的表达后，发现CNE1细胞的增殖不受影响，但对顺铂的药物敏感性显著增强[28]。

3 Nrf2-ARE通路参与肿瘤细胞的耐药过程

在肿瘤演进过程中，肿瘤细胞会因基因突变或通过化疗药物的选择对临床放化疗治疗产生耐受性，而Nrf2-ARE通路可参与其中的每个环节。

3.1Keap1/Nrf2基因突变与肿瘤耐药 在食管、皮肤及肺等器官的鳞状细胞癌中常出现Nrf2基因突变，突变后Nrf2蛋白仍保留转录活性，却失去与Keap1的结合能力，其下游靶基因的表达不受Keap1介导的负性调控，进而使肿瘤细胞能耐受放化疗。肿瘤耐药细胞不仅存在高表达Nrf2的情况，也在肺、肝胆、卵巢及乳腺等肿瘤中发现因Keap1突变引起的Nrf2-ARE通路激活，Keap1的突变或异常低表达也是肿瘤耐药的重要机制之一。在生理状态下，野生型Keap1可以结合到IκB激酶β抑制剂分子上，抑制IκB激酶β磷酸化和介导自噬依赖的IκB激酶β降解，参与有促炎和促癌作用核因子κB信号的负调控。若Keap1基因发生突变，肿瘤细胞内的核因子κB通路被激活，肿瘤细胞增殖能力增强，可耐受化疗药物的作用[29]。研究发现，与正常呼吸道上皮细胞相比，Keap1在肺癌细胞系和组织中的表达降低，且Keap1的启动子呈高甲基化状态，Keap1表达量降低可能与癌细胞表观遗传学变化有关[30]。

3.2Nrf2-ARE通路的活化与肿瘤耐药 在长期的化疗药物治疗过程中，肿瘤细胞往往通过多种途径获得耐药能力，使适应性的肿瘤细胞群体选择性增多。化疗药物刺激肿瘤细胞产生高水平的活性氧类，在持续的氧化应激条件下，肿瘤细胞激活氧化还原敏感的转录因子Nrf2，使Nrf2-ARE通路下游靶基因如Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶系及药物转运体等蛋白表达上调，而这些蛋白大多在抗肿瘤药物的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相代谢过程中发挥作用，能增强肿瘤细胞对抗氧化应激和化疗药物的能力，导致耐药性逐渐增强。顺铂及烷化剂等抗癌药物通过激活肿瘤细胞Nrf2-ARE通路，使受其调控的抗氧化酶、Ⅱ相解毒酶及药物流出泵蛋白的表达增加，从多个步骤促进化疗药物体内代谢，增强肿瘤细胞的MDR。可见，Nrf2是一种可被肿瘤细胞在解毒、抗氧化及化疗药物泵出等多个环节利用的保护性转录因子。研究发现利用药物控制Nrf2的表达水平和活性可抑制胰腺癌细胞的生长，并能增加其对化疗的敏感性[31]。化疗药物5-氟尿嘧啶通过激活Nrf2-ARE通路，可显著增加人结肠癌HT-29细胞的耐药性[32]；研究发现，Nrf2抑制剂鸦胆子苦醇可加速Nrf2的泛素化过程，降低细胞内Nrf2水平，增强顺铂对肺癌A549细胞毒性，进而使顺铂对癌细胞的杀伤程度进一步加强[33]。与单用顺铂的异种移植A549细胞的裸鼠组相比，鸦胆子苦醇和顺铂共处理组在诱导细胞凋亡和抑制肿瘤生长方面有显著效果；Nrf2低表达的A549-K异种移植裸鼠对鸦胆子苦醇处理无反应，表明鸦胆子苦醇介导的对顺铂的致敏作用依赖于Nrf2的表达[34]。药物能通过抑制Keap1或Nrf2的功能有效干预Keap1-Nrf2-ARE通路，克服肿瘤细胞化疗耐药，因此在未来临床治疗肿瘤时Keap1-Nrf2-ARE通路是潜在的抗癌药物作用的靶点，是提高化疗效果的新途径。

3.3Nrf2-ARE通路与自噬串话参与肿瘤耐药 研究发现，自噬和Nrf2-ARE通路存在交互作用，通过发挥增强防御、加速药物代谢等作用促进肿瘤的演进，参与放化疗的耐受过程。多功能蛋白p62是参与细胞自噬体构成的调节因子之一，可将绑定的泛素化蛋白聚合体运送至自噬体进行酶解。p62可直接与Keap1相互作用，使Keap1与泛素化合物-自噬体连接降解，转录因子Nrf2入细胞核后，激活ARE调控的下游一系列细胞保护性基因的表达。在丙型肝炎病毒阳性患者的肝癌细胞内，持续磷酸化的p62与Keap1亲和力增强，介导Keap1降解后，激活Nrf2-ARE通路参与肝癌细胞的发生、发展；若敲除肝癌细胞细胞系中的p62可显著抑制肿瘤生长[35]。此外，Nrf2还诱导p62表达，导致Nrf2通过p62-Nrf2-Keap1通路的正反馈环持续激活。与卵巢癌A2780细胞相比，A2780cp耐药细胞过表达Nrf2及其靶基因醌氧化还原酶1和血红素氧化酶1，抑制A2780cp细胞Nrf2通路可降低p62mRNA和蛋白的表达，增加A2780cp细胞对顺铂治疗的敏感性，Nrf2激活的自噬可能是引起卵巢癌耐药细胞株A2780cp顺铂抗性的原因[36]。但也存在不同的结论，用哺乳动物雷帕霉素和天然植物产物烯丙基巯基半胱氨酸干预结直肠癌HCT-116细胞和结直肠癌鼠模型时，发现激活的Nrf2-ARE通路上调其下游抗氧化基因醌氧化还原酶1的转录表达，同时p62表达下调，提示p62在Nrf2与自噬之间存在负调控作用[37]。抗癌药物可在不同程度上诱导多种类型癌细胞发生自噬和(或)激活Nrf2通路，进而对细胞存活产生不同的影响，关系极为复杂，这可能与癌细胞的遗传背景、决定细胞命运的相关通路间的交互作用有关。基于自噬途径和Nrf2-ARE通路探讨肿瘤细胞化疗耐药机制，解析肿瘤细胞耐药原因，对研发新型抗癌靶标药物有重要的现实意义。

4 小 结

肿瘤的演进过程与肿瘤细胞基因突变、表观遗传学改变及多条通路交互作用积累有关，是一个渐进式过程。在临床治疗过程中，肿瘤细胞MDR也同样涉及以上各个环节，宿主因素、癌细胞的特定遗传背景改变、调控细胞增殖分化及应对应激因素等相关信号通路的交互反应都决定着癌细胞命运转归，其中Nrf2-ARE通路是参与肿瘤MDR各个环节的关键通路，并与自噬相关蛋白p62有复杂的交互作用。目前肿瘤细胞MDR机制已初步明确，但仍未得到有效的解决途径，故进一步针对Nrf2-ARE通路导致肿瘤化疗抵抗与耐药的研究仍非常必要。