小米蛋白的分子组成及结构特性

郭莲东，徐 丽，欧才智，丁阳月，张高鹏，倪春蕾，程建军*

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

小米（Setaria italica Beauv.），禾本科狗尾草属植物，是谷子脱壳后的产物，但它并不是一个单一品种，而是珍磁稷、谷子、黍以及穇子[1]等几种小粒谷物的总称。小米的营养价值与其他谷物相比相当或更优[2]。与大米和小麦相比，小米含有较高的钙、膳食纤维和蛋白质[3]；与水稻、玉米和高粱等谷物相比，小米的蛋白质含量与之相等甚至更高[4]。

存在于谷物种子中的蛋白质是在种子发育阶段特异性合成的，且受到营养素的调节[5]。传统上，这些蛋白质根据溶解度的物理性质分为清蛋白（水溶性）、球蛋白（盐溶性）、醇溶蛋白（醇溶性）和谷蛋白（碱溶性）[6]。其中，醇溶蛋白和谷蛋白[7-9]在大多数谷物中含量较高，受到较多关注。玉米醇溶蛋白不溶于水，但在醇、高浓度尿素、碱（pH≥11）或阴离子洗涤剂存在下可溶，这是由于非极性氨基酸残留的比例很高，并且缺乏酸性和碱性氨基酸的缘故[8]。玉米醇溶蛋白可分为α-、β-、γ-、δ-醇溶蛋白[10]，α-醇溶蛋白含量占醇溶蛋白总含量的75%～80%，并且根据略有不同的分子质量（19、22 kDa）分为两组。麦醇溶蛋白主要是单体蛋白质，被分为α-、β-、γ-、ω-麦醇溶蛋白，其分子质量为28～55 kDa。麦谷蛋白是一种聚合物，并且可分为高分子质量组（70～90 kDa）和低分子质量组（20～45 kDa）[11]。麦醇溶蛋白和麦谷蛋白亚基都具有异常高水平的脯氨酸和谷氨酰胺[5]。与小麦、大麦和玉米相比，小米具有较高比例的醇溶蛋白和谷蛋白[12]。其中，小米醇溶蛋白可分为α-、β-、γ-醇溶蛋白[13]，且分子质量较小（约25～26 kDa）[12]；而谷蛋白，一般可以分为高分子亚基组和低分子亚基组[11]。除此之外，有研究表明小米中的蛋白质可能以聚集体的形式存在[14]。赵学伟等[15]对4 种小米蛋白组分的提取、溶解性等功能性质以及相对分子质量做了一定的研究。

目前，谷物蛋白中研究较多的是大豆[16-17]、小麦[7,18]和玉米蛋白[10,19]等，本研究旨在探讨小米蛋白组分的结构特性，以期为今后小米产品的开发与应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米（龙谷25） 黑龙江省肇源县古龙镇；考马斯亮蓝G250和R250 上海跃腾生物技术有限公司；氢氧化钠、无水乙醇、磷酸 天津市天力化学试剂有限公司；氯化钠 天津市光复科技发展有限公司；甲醇天津市富宇精细化工有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）制备试剂盒、牛血清白蛋白 北京索莱宝科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷 北京太阳神科技有限公司；甘氨酸 北京生物科技有限公司。所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UVmini-1240紫外-可见分光光度计 岛津仪器（苏州）有限公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；BG-Power 600i SDS-PAGE仪 北京百晶生物技术有限公司；Alpha 1-2 LDplus冷冻干燥机德国Christ公司；SU8010扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 日本Hitachi公司；DSC 3+差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）仪 瑞士梅特勒-托利多公司；ALPHA-T傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）仪 德国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 小米蛋白组分的制备

将小米粉碎过80 目筛，使用索氏抽提法将小米粉中脂肪除去，使用脱脂后的小米粉进行蛋白质的提取。由于传统上将谷物蛋白根据溶解度分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[6]。用Osborne法[20]分离提取出清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。清蛋白和球蛋白分别是水溶性蛋白及盐溶性蛋白，醇溶蛋白溶于醇溶液，谷蛋白溶于碱性溶液。因此，分别使用蒸馏水、3%氯化钠溶液、75%乙醇溶液以及氢氧化钠溶液按照以下流程对脱脂小米粉进行蛋白质的提取（图1）。

图1 小米蛋白组分提取的工艺流程Fig. 1 Flow chart of the extraction process for millet protein components

1.3.2 小米蛋白组分含量测定

使用凯氏定氮法[21]确定小米中蛋白质的含量。

1.3.3 SDS-PAGE分析

参考Laemmli[22]的SDS不连续电泳法并稍作改进。将样品溶于样品溶解液中，后于100 ℃煮沸3 min，冷却后待用。分别配制15%分离胶以及5%浓缩胶，待胶凝固后可开始上样，依次加入5 μL Marker，以及10 μL样品，上样后打开电泳仪将电压调至80 V，当试样到浓缩胶底端时，电压调至120 V继续实验，当试样带距边缘1 cm处停止电泳。将胶体取出，浸于染色液中染色后，于脱色液中脱色，直到蛋白质区带清晰。然后绘制标准曲线，计算相对迁移率以及相对分子质量。

1.3.4 SEM观察

使用SU8010 SEM观察小米蛋白组分的微观形态。在加速电压为5 kV的条件下，于5 000～20 000不同放大倍数下观察样品，并使用内置软件捕获图像[14]。

1.3.5 DSC分析

使用DSC仪测量热稳定性。将1～3 mg蛋白质样品置于铝盘内，铝盘用铝盖密封，然后以2.0 K/min的速度在0～300 ℃条件下，使用干燥氮气以50.0 mL/min恒温吹扫。使用密封的空铝盘作为参考。通过STARe软件从热分析图谱中分析变性温度[23]。

1.3.6 FTIR分析

使用FTIR仪研究小米蛋白组分的二级结构。使用溴化钾压片法，将经过冷冻干燥的样品置于机器上以记录300～4 000 cm-1范围内的光谱变化，用32 次扫描和4 cm-1分辨率记录FTIR光谱[24-25]。

1.4 数据分析

每组实验进行3 次作为平行，使用SPSS软件（Windows 13.0）对数据进行显著性分析，并使用OriginPro 8.5作图。P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 小米蛋白组分含量

经凯氏定氮法测定，小米中总蛋白质质量分数为10.47%，清蛋白占总蛋白含量的4.12%，球蛋白为11.42%，谷蛋白为20.77%，醇溶蛋白为43.02%，与魏益民等[13]研究的结果相似。

2.2 蛋白组分亚基分析

图2 小米蛋白组分的SDS-PAGE图Fig. 2 SDS-PAGE images of the millet protein components

由图2可知，清蛋白具有多条谱带，在分子质量11～100 kDa的范围内均有存在，并且高低分子质量范围内各有1 条较明显的谱带，分别为108.17 kDa和23.98 kDa；球蛋白的谱带主要集中在低分子质量范围内（11～25 kDa），主要由22.77 kDa等分子质量较小的亚基组成；醇溶蛋白由3 条比较明显的谱带，其分子质量分别为18.96、11.86、24.94 kDa等小分子亚基组成，这3 条谱带分别称为α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白[13]；谷蛋白存在多条谱带，可分为低分子亚基组（11～48 kDa）以及高分子亚基组（48～180 kDa），但无特征谱带出现。同时发现，这4 种蛋白组分有亚基重合现象，如24.94 kDa和16 kDa的亚基在4 种蛋白条带上均有出现，但条带深浅不同，可能是蛋白含量不同导致的；分子质量为108.17 kDa和63 kDa的亚基在清蛋白和球蛋白上均有出现，说明清蛋白与其他3 种蛋白组分中存在相同的亚基条带。

2.3 蛋白组分的微观结构

图3 小米中4 种蛋白组分的SEM图Fig. 3 SEM images of four protein components in millet

从图3a可见，放大5 000 倍可以清晰地看到清蛋白颗粒，但某些颗粒呈现不规则的球状，其粒径范围约在604～2 500 nm之间，较其他3 种蛋白组分的粒径偏大；而在图3b可以看到，球蛋白以簇状形态存在，颗粒形状不规则，其粒径范围约在319～847 nm之间。醇溶蛋白和谷蛋白均以颗粒形式存在，但是其聚集状态存在较大差异，醇溶蛋白分子连接紧密，其粒径范围约在202～1 310 nm之间，而谷蛋白颗粒之间连接松散，表面光滑，粒径范围约在225～686 nm之间（图3c、d）。Gulati等[14]在黍米粉和提取的蛋白质中观察到球形蛋白体，以簇状形态存在，并认为这很有可能是提取过程和样品制备造成的结果，与本次实验结果相似。Liao Lan等[7]使用原子力显微镜观察了小麦面筋蛋白的微观结构，发现小麦面筋蛋白是一种由类岛状和条状聚集体复合形成的复杂网络。小米蛋白与小麦蛋白相似，均以聚集体的形式存在。

2.4 热特性分析

图4 小米中4 种蛋白组分的DSC曲线Fig. 4 DSC curves of four protein components in millet

热变性是通过共价和非共价以及疏水相互作用的分子聚集而诱导蛋白质变性[26]。图4显示了醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白的DSC热分析图谱。这4 种小米蛋白组分的变性温度分别为110.67、84.80、98.97、71.33 ℃，对应的焓变（ΔH）分别为75.61、78.60、52.23、6.37 J/g。而蛋白质变性所需的能量反映了将其解离成更简单的结构以及展开蛋白质所需的能量，当蛋白质结构更稳定时，变性温度就会更高[23]，因此，醇溶蛋白的结构可能比其他3 种蛋白质更稳定。蛋白质有序构象的情况则通过焓变反映出，焓值变化较小表明变性所需要的能量越小[27]，且根据SEM图（图3）可以看到，球蛋白颗粒并不像其他3 种蛋白组分较为密集地聚集在一起，可能是谷蛋白颗粒之间的疏水相互作用更强导致的。因此在达到变性温度后，球蛋白更易于变性，而醇溶蛋白、谷蛋白和清蛋白则需要吸回更多的热量后才发生变性[28]。

2.5 FTIR分析

图5 小米中4 种蛋白组分的FTIR图谱Fig. 5 FTIR spectra of four protein components in millet

图5 清晰地显示了小米中醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白的特征红外吸回峰。存在于1 700～1 200 cm-1之间的吸回峰包含蛋白质和多糖的振动区域[29]。其中酰胺I带的吸回峰发生在1 600～1 700 cm-1处，它主要是由C＝O以及较弱的C—N伸缩和N—H弯曲引起的[30]。在图5中，可以看到醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白在此范围内有1 649、1 645、1 644、1 648 cm-1处的吸回峰；酰胺II带发生在1 500～1 600 cm-1处，主要是由于C—N伸展以及N—H弯曲振动产生的，图中分别处于1 518、1 526、1 530、1 523 cm-1的吸回峰则对应酰胺II区域；以及1 444、1 440、1 425、1 424 cm-1附近的酰胺III带（C—N吸回峰）。在3 285 cm-1处4 种蛋白样品出现了强且宽的吸回峰，这主要是O—H键伸缩振动吸回，该吸回峰较强所以干扰了出峰位置相近的N—H伸缩振动吸回峰。

而多糖的吸回峰所在的区域位于900～1 200 cm-1，在此范围内出现了多糖及其糖类异构体的吸回，其中1 145 cm-1附近吸回峰归属为C—O以及C—C键的伸缩振动；1 012 cm-1附近吸回峰归属为C—O键的伸缩振动以及C—OH的弯曲振动。这可能是由于蛋白组分中存在糖蛋白，这有待于进一步探讨。

拟合图谱中各子峰与二级结构对应关系为：1 650～1 660 cm-1附近的吸回峰为α-螺旋，1 610～1 642 cm-1为β-折叠结构，1 660～1 680 cm-1为β-转角，1 680～1 700 cm-1为β-反平行折叠，1 642～1 650 cm-1为无规卷曲[31]。从表1可以看到，小米蛋白的二级结构中存在α-螺旋、β-折叠、β-转角、β-反平行折叠，但是未发现无规卷曲结构。除清蛋白外，其他3 种蛋白组分中均以β-折叠结构为主，其次是α-螺旋和β-转角，β-反平行折叠含量最低，醇溶蛋白的β-转角以及β-反平行折叠结构最丰富，并与其他蛋白结构含量差异显著（P＜0.05）。本研究结果与Beck等[32]等通过挤压豌豆分离蛋白所形成的蛋白质聚集物二级结构的组成一致，都是由α-螺旋、β-折叠、非共价键合的β-转角或反平行β-折叠结构形成。

表1 小米蛋白组分的二级结构含量Table 1 Secondary structure contents of millet protein components

3 结 论

通过SDS-PAGE、SEM、DSC以及FTIR对小米中的4 种蛋白组分进行结构分析。从SDS-PAGE图像观察到醇溶蛋白是由低分子质量亚基（11～25 kDa）构成，有3 条比较明显范围的条带，分别为α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白；而清蛋白、球蛋白和谷蛋白亚基分布较广（11～180 kDa），其中清蛋白所含亚基数目最多，并且清蛋白与其他3 种蛋白组分中存在相同的亚基条带，如24.94 kDa和16 kDa的亚基在4 种蛋白条带上均有出现。

SEM图与DSC图谱显示，球蛋白颗粒并不像其他3 种蛋白组分较为密集地聚集在一起，且焓值变化较其他3 种蛋白组分更小，因此在达到变性温度后，球蛋白更易于变性。而醇溶蛋白的变性温度最高，其蛋白质结构较其他3 种蛋白质的结构更稳定。

FTIR图谱显示，4 种蛋白组分处于酰胺I带的吸回峰对应α-螺旋、β-折叠、β-转角、β-反平行折叠，但是未发现无规卷曲结构。除清蛋白以外，其他3 种蛋白组分的二级结构含量：β-折叠＞α-螺旋＞β-转角＞β-反平行折叠。醇溶蛋白的β-转角以及β-反平行折叠结构含量比其他3 种蛋白组分更丰富，并与其他蛋白结构含量差异显著（P＜0.05）。