基于不同培养基底的肝癌细胞成像及力学特性分析

谢莹，王佳佳，王莹，曲英敏

（长春理工大学 国家纳米操纵与制造国际联合研究中心，长春 130022）

二十世纪八十年代初，扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscope，STM）的问世，使得人类首次实现了对单个原子在物质表面排列状态的实时观察，这对材料科学和生命科学等领域产生了深远且不可磨灭的影响。扫描隧道显微镜的工作原理是基于量子力学的隧道效应，这就要求所观察的物体必须具有一定的导电能力，因而在一定程度上限制了它的应用范围。为了弥补这一不足，Binnig等人于1986年在扫描隧道显微镜的基础上成功研制出了原子力显微镜（Atomic Force Microscope，AFM）［1］，在纳米尺度上实现了对导电和非导电样品的三维观测。原子力显微镜具有对测试材料不敏感以及对应用环境要求宽松等优点，所有操作可在特定气体、大气和液相（如生理缓冲液等）中进行，甚至可直接在近生理条件下实现对生物细胞［2］、病毒［3］、蛋白质分子［4］等的实时监测、表征和操纵，并输出具有超高分辨率的三维图像及信息，这种独特的优势使其逐渐发展成为细胞生物学研究中的有效工具［5］。随着时间的推移，人们逐渐认识到AFM是直接表征生物样品表面信息和力学性能的理想工具［6-9］。

肝癌，即肝脏恶性肿瘤，是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤。肝癌的发病原因是受环境和饮食等多因素、多步骤影响的复杂过程，且其分子机制尚不完全清楚。据统计，我国肝癌的年死亡率在恶性肿瘤死亡顺位中占第二位，但截至目前为止，仍然缺少预防或治疗肝癌的有效手段，导致病患在身体和心理上遭受巨大的痛苦。由于癌症的可怕性及危害性，人人谈癌色变。目前，在全世界范围内每年都投入巨大的人力和物力致力于研发治疗癌症的有效方式和药物，虽然取得了一定的进展，但仍然难以解决治愈癌症的难题。

形貌特征和力学信息是细胞的两个基本特性，与细胞的基本功能直接相关，并且可以作为判断疾病状态的参考指标。为了推动相关领域对病变细胞特征的深入研究，进一步了解肝癌突变细胞的形貌和力学信息，为癌症药物的研发和疗效评估提供参考依据，本文以人肝癌细胞SMMC-7721为样本，采用 AFM（JPK NanoWizard® 3 BioScience）对培养于盖玻片、石英和ITO表面的细胞形貌特征和力学特性进行了深入的测量和对比分析。

1 AFM工作原理

AFM是一种纳米级测量分析仪器，也能够进行纳米刻蚀、纳米操纵，细胞与基底或细胞间相互作用力谱实验。AFM主要由力检测单元、光传感单元和反馈单元构成，如图1所示［10］。在该系统中，利用微悬臂检测探针针尖与待测样品表面之间不断变化的相互作用力，这种力的变化会促进微悬臂的摆动，进而使得照射在微悬臂末端的激光反射光的位置发生偏移，从而引起四象限中光电探测器的位置发生改变，反馈系统根据其位置的改变量对系统做出调整指令，然后计算机将数据加以分析处理并转换成图像呈现出来。

图1 AFM系统示意图

以探针与样品表面距离的不同为依据，AFM的工作模式可以划分为接触成像模式（Contact Mode）、非接触成像模式（Non-Contact Mode）和轻敲模式（Tapping Mode）。

接触成像模式，也被称为静态扫描模式，是AFM中较为常用的工作模式。在成像过程中，探针尖端始终在样品表面上方震荡并与样品表面保持一定程度的接触，这种持续性的接触可能会对样品表面造成一定程度的损坏。接触模式利用样品与探针间不断改变的作用力（主要是原子间的库伦排斥力）引起微悬臂的不同形变，进而得到样品表面形貌信息的高分辨率图像。

在非接触模式成像过程中，探针始终在距离样品表面几个纳米的位置震荡以减小对样品的损伤。在这种工作模式下，原子间的相互作用以范德华吸引力为主，但由于针尖与样品的非接触导致图像分辨率低，容易引起反馈不稳。非接触模式的探针振动会对液体造成较大的扰动，所以该模式不适用于液相下工作，这在一定程度上限制了它的应用范围。

轻敲模式的工作原理与上述两种方式有所不同，探针的微悬臂始终在其共振频率范围内保持振动，并通过在一定的时间间隔内敲击样品表面的形式与样品保持短暂的接触，既不会损伤样品也能解除对分辨率的影响。在这种工作模式下，反馈系统会根据探针振动频率的变化及时更改压电陶瓷施加的电压值，从而获得样品的表面形貌。

在JPK系统中，存在一种特殊的工作模式，即Quantitative Imaging（QI）模式，其工作原理与轻敲模式相似，在获得样品形貌的同时还能够得到每一个像素对应的力学曲线，主要用于对生物样品的测量，文章中展示的图像均是通过QI模式获得的。

2 实验材料及方法

（1）细胞

将人肝癌细胞SMMC-7721置于含有10%胎牛血清（FBS，HyClone）的RPMI-1640培养液（Hy-Clone）中，并在环境温度为37°、CO2含量为5%的细胞培养箱中培养数天。要求每天对细胞进行一次培养液更换并检查细胞的生长状态，当细胞繁殖到覆盖80%的培养瓶时，用1 mL胰蛋白酶处理1分钟使其变成悬浮液，然后用移液枪量取40 μL的细胞悬浮液并分别平铺到盖玻片、石英和ITO基底上。实验前，将细胞取出，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓缓地冲洗基底上的细胞，以去除杂质和凋亡细胞。

（2）探针

在细胞成像和杨氏模量测量的过程中，选择悬臂梁材料为氮化硅的探针（MLCT，BRUKER）进行实验。探针给定的弹性系数为0.07 N/m，针尖半径为20 nm，共振频率为22 kHz。在实验开始前，以硅片为参考对象对探针的弹性系数进行了校准，校准后的数值为0.065 N/m，并将这一数值用于以下的力学数据测量和计算中。

3 实验结果

（1）细胞成像

表面形态特征对于癌细胞的研究是必不可少的，为了获得基底材料对细胞形态的影响，将培养于近生理条件下的SMMC-7721肝癌细胞在QI模式下进行了成像实验。在图像扫描范围为50 μm×50 μm，扫描速度为300 μm/s，像素设置为256×256的条件下，获得了如图 2（a）、图 2（b）和图 2（c）所示的三组分别培养于盖玻片、石英和ITO基底的SMMC-7721活细胞的表面形貌图。从图中可以看出，培养于盖玻片和石英基底的细胞整体呈现椭圆形结构，且表面光滑，轮廓清晰，细胞表面没有明显的杂质；而培养于ITO基底的细胞呈现出类梭形结构，细胞膜表面的精细结构清晰可见。

为了获得培养于上述三种基底的SMMC-7721肝癌细胞在横向和纵向伸展的差异，选取图2（a）-图2（c）中虚线位置的断面，对细胞横截面的高度和宽度数据进行测量，对应的实验结果显示于图2（d）-图2（f）中。由此可以看出，细胞的生长呈现出中间高两侧低的趋势，最高位置出现在细胞中心线附近。相比较来说，这三种基底对细胞的生长尺寸影响不大，其宽度在25 μm左右，高度在4 μm左右。

（2）黏附力测量

为了获得细胞与探针间的黏附信息，相关的图像处理软件也被用于分析细胞在成像过程中与探针间作用力的大小，由此得到了细胞-探针之间对应的黏附力，并绘制成如图3所示的细胞-探针黏附力分布图。由图片右侧的标尺信息可知，图中较暗的区域与较小的黏附力相对应，较亮的区域与较大的黏附力相对应。三者的黏附关系均呈现出由细胞中心向四周逐渐增加的趋势，最低值位于细胞中心附近。此外，培养于盖玻片基底的细胞-探针之间的黏附力稍大一些，石英和ITO基底的细胞-探针之间的黏附力大小相当。总体来说，细胞-探针之间的黏附力小于基底-探针之间的黏附力。

为了进一步统计在不同基底上生长的SMMC-7721肝癌细胞与探针间作用力的大小，在每一种基底上选取10个形态较好的细胞作为样本，其中每个细胞选择10个测试点，并将对应位置的细胞-探针间的作用力数值统计成如图5所示的统计图。由此可以看出，生长在盖玻片上的细胞与探针间的黏附力范围稍大，石英基底的细胞与探针间的黏附力范围较小，ITO基底的细胞与探针间的黏附力分布较平均。

图2 培养于不同基底的SMMC-7721肝癌细胞的AFM图像及与之对应的细胞高度-宽度图

图3 培养于不同基底的SMMC-7721肝癌细胞与探针间的黏附关系

图4 培养于不同基底的SMMC-7721肝癌细胞与探针间的黏附统计图

图5 培养于不同基底的SMMC-7721肝癌细胞的杨氏模量分布图

（3）杨氏模量测量

为了表征基底对SMMC-7721肝癌细胞力学特性的影响，了解细胞表面的硬度分布及杨氏模量信息，采用三角锥形探针对细胞进行了压痕实验。在完成探针弹性系数的校准、基线调整以及寻找接触点等一系列必要操作后，采用Hertz模型对细胞进行力学特性分析，并获得了如图5所示的培养于不同基底的SMMC-7721肝癌细胞杨氏模量分布图。图中较暗的区域对应较低的杨氏模量值，代表硬度低，而较亮的区域对应较高的杨氏模量值，代表硬度高。从图中可以看出，在三种不同基底生长的细胞杨氏模量范围大小相当，即基底导致的细胞杨氏模量值的差异并不显著，且细胞边缘的杨氏模量明显低于中心位置的杨氏模量，即细胞中心的硬度更高。

为了进一步掌握基底引起的SMMC-7721肝癌细胞杨氏模量的差异，在每种基底上对10个细胞样品进行了统计，其中每个细胞采集10个数据，结果如图6所示。由此可以看出，三种基底的细胞杨氏模量均在700～1 100 Pa区间分布较为集中，而在较低值和较高值区间的分布相对零散，但三者分布趋势的差异并不显著。

4 结论

本文利用AFM技术对人肝癌细胞SMMC-7721的形貌及力学特性进行了表征，着重分析了不同基底的细胞在形貌、细胞-探针间粘附关系和细胞表面杨氏模量的分布等三个方面的差异，并得到基底对细胞大小和杨氏模量的分布影响较小，而细胞与探针间的黏附稍有差别。进一步确定了SMMC-7721细胞的基础力学信息，希望能够为临床医学提供参考，促进癌症药物的研发。

图6 培养于不同基底的SMMC-7721肝癌细胞的杨氏模量统计图