苦参碱对PRRSV/LPS共刺激诱导小鼠炎症反应的作用

孙盼盼，侯雅鑫，张宇瞳，赵 瑾，裴亚萍，孙 娜，徐银兰，何永明，李宏全

(1.山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801；2. 佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528225)

近几年，中药及其提取物在防治动物疾病、提高机体免疫功能、缓解炎症反应等临床应用中显示出良好的效果。苦参碱(Matrine，MT)是从苦参、山豆根和苦豆子等药用植物的根茎中提取分离的一类生物碱，已有文献报道，苦参碱能减轻卵清蛋白诱导的小鼠呼吸道炎症[1]；以IL-10缺陷引起的小鼠肠炎为模型，苦参碱可抑制TNF-α等促炎因子的释放，缓解肠炎症状[2]；本实验室前期研究表明，苦参碱对猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)/猪圆环病毒2型(PCV2)共感染诱导的小鼠间质性肺炎有显著的治疗作用，并且改善脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤[3-4]。这些结果提示苦参碱具有抗炎作用，但是其具体的抗炎机理还不清楚。

猪感染PRRSV后的主要临床症状是繁殖障碍和间质性肺炎，并且以出现免疫抑制为特点，常与其他猪病混合感染或者继发感染，而与其他病原体的共感染在PRRSV诱导的炎症反应中也具有重要地位[4-8]。本实验室前期试验结果显示，苦参碱能够抑制PRRSV在Marc-145细胞和猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages，PAMs)中的复制[9-11]；PRRSV 5'UTR RNA和LPS共刺激PAMs后，IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达显著高于各单独作用组，而苦参碱作用后能显著降低这些促炎因子的表达[12]。因此，本试验通过PRRSV和LPS共刺激小鼠为模型，检测苦参碱对PRRSV/LPS共刺激诱导小鼠炎症反应的影响，探索苦参碱可能的抗炎机制，为苦参碱作为抗PRRSV药物的临床应用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物、病毒和实验动物 苦参碱购自中国南京泽郎生物科技有限公司，批号：ZL20171212SCZS，含量98.0%。PRRSV(JS-1)由江苏省农业科学院赠，经Marc-145细胞增殖后测定病毒TCID50为10-5.86。雌性昆明系小鼠，清洁级，体重20±2 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 主要试剂和仪器 LPS、苏木素染色液、伊红染色液和中性树胶,购自北京索莱宝科技有限公司；TRIZol和PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser,购自大连TakaRa公司；2×SYBR Green Low ROX qPCR Master Mix,购自上海毕傲图生物科技有限公司；小鼠Th17/Treg细胞表型检测试剂盒,购自美国BD公司。ND-1 000核酸蛋白浓度测定仪(NanoDrop，美国)；ABI 7 500定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)；离心机(Sigma，德国)；全自动血液细胞分析仪(Healife，中国)；全自动生物组织切片机(Leica，德国)；光学显微镜(Olympus，日本)；FACS Calibur流式细胞仪(BD，美国)。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 将100只雌性昆明系小鼠随机分为5组(空白组、LPS组、PRRSV组、PRRSV和LPS组、苦参碱作用组)，每组20只。LPS作用组：腹腔注射20 mg/kg·bw LPS；PRRSV作用组：PRRSV 10倍稀释后腹腔注射0.5 mL；LPS和PRRSV共刺激组：同时给予LPS和PRRSV；苦参碱作用组：LPS和PRRSV共刺激30 min后，每只小鼠以40 mg/kg·bw的剂量,腹腔注射苦参碱，每隔24 h给药1次，连续给药3次；空白对照组:注射等体积生理盐水。PRRSV和LPS共刺激1 d和7 d后，每组随机选取10只小鼠剖检，采集血液，固定及冻存肺脏，分离提取脾脏细胞。

1.2.2 血液中白细胞数的检测 收集血液，采用全自动血液细胞分析仪进行血常规检测，统计各组小鼠白细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞数的变化。

1.2.3 肺组织病理学观察 取部分左肺，用苦味酸溶液固定24 h后，经脱水、透明、石蜡包埋，切片，然后进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，H.E.)染色，光镜下观察小鼠肺组织的病理形态学变化。

1.2.4 qRT-PCR检测小鼠肺组织中IL-1β、TNF-α mRNA表达量 取冻存的肺组织放到预冷的研钵中，充分碾磨后，加入1 mL TRIZol，按说明书提取组织总RNA。以合成的cDNA为模板，β-actin为内参基因，采用相对荧光定量PCR(2-ΔΔCt)检测各个样本中IL-1β、TNF-α mRNA的相对表达量。

表1 引物序列及PCR产物大小

1.2.5 脾细胞中Th17、Treg细胞数的检测 分离小鼠脾脏后，无菌生理盐水洗净脾脏表面血渍，剪碎研磨后过滤，1 500 r/min离心5 min，弃上清，红细胞裂解液裂解红细胞后，PBS洗2遍，经细胞计数后用2% 1 640培养基重悬细胞。按照美国BD公司小鼠Th17/Treg细胞表型检测试剂盒说明书进行抗体孵育，流式细胞术检测脾淋巴细胞中Th17/Treg细胞的变化。

1.3 数据分析 所有数据均采用GraphPad Prism 5软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，流式细胞仪数据用 CELL Quest 软件获取，结果均以Mean ± SEM表示。

2 结果

2.1 苦参碱抑制PRRSV/LPS共刺激引起的小鼠肺脏病变 H.E.染色结果显示，1 d和7 d时，空白组小鼠肺组织结构清晰，肺泡结构完整，肺泡壁厚度正常(见中插彩版图1)。LPS、PRRSV单独刺激诱导小鼠肺脏发生病理变化，但共刺激组小鼠肺组织病变程度更严重，表现为结构不清晰，肺间隔明显增宽、肺泡腔显著缩小等典型的间质性肺炎特征；苦参碱处理后能显著改善肺间隔增宽等病理现象。

2.2 苦参碱对PRRSV/LPS共刺激小鼠白细胞含量的影响 白细胞是一类无色、球形、有核的血细胞，根据其形态、功能和来源部位可分为3大类：粒细胞、单核细胞和淋巴细胞。机体发生炎症反应时可引起白细胞总数及各种白细胞的百分比发生变化，血常规检测结果显示(图2)，PRRSV和LPS共刺激小鼠1 d时，与空白组相比，LPS单独刺激和共刺激组中白细胞和淋巴细胞数显著降低(P<0.05)；单独PRRSV刺激显著升高白细胞和淋巴细胞数(P<0.05)；所有刺激对单核细胞和粒细胞数没有显著影响(P>0.05)。与共刺激组相比，苦参碱处理对各种血细胞的含量没有显著影响(P>0.05)。在7 d时，与空白组相比，LPS单独刺激和共刺激组中淋巴细胞数显著升高(P<0.05)，粒细胞、单核细胞以及淋巴细胞数没有显著变化(P>0.05)；PRRSV单独刺激对各种白细胞的含量没有显著影响(P>0.05)。与共刺激组相比，苦参碱处理显著降低单核细胞数，对其他3种血细胞的含量没有显著影响(P>0.05)。

图2 苦参碱对PRRSV/LPS共刺激小鼠血液中白细胞、粒细胞、单核细胞以及淋巴细胞含量的影响

注：不同字母a、b、c表示差异显著，P<0.05

2.3 苦参碱对PRRSV/LPS共刺激小鼠肺脏TNF-α和IL-1β mRNA的影响 荧光定量PCR检测结果显示，在PRRSV和LPS共刺激1 d时，与空白组相比，PRRSV或LPS单独刺激对IL-1β(图3A)和TNF-α(图3B)的表达没有显著影响(P>0.05)，共刺激显著升高肺脏中TNF-α的表达(图3B)(P<0.05)，对IL-1β的表达没有影响(图3A)(P>0.05)；与共刺激组相比，苦参碱处理后显著降低肺脏中TNF-α的表达(图3B)(P<0.05)，对IL-1β的表达没有影响(图3A)(P>0.05)。在7 d时，PRRSV单独刺激显著升高IL-1β的表达(图3C)，LPS单独刺激对IL-1β和TNF-α的表达没有显著影响(图3C和图3D)(P>0.05)，PRRSV和LPS共刺激显著升高肺脏中IL-1β和TNF-α的表达(图3C和图3D)(P<0.05)；与共刺激组相比，苦参碱处理显著抑制IL-1β的表达(图3C)(P<0.05)，对TNF-α的表达没有影响(图3D)(P>0.05)。

图3 苦参碱对PRRSV/LPS共刺激小鼠肺脏IL-1β和TNF-α mRNA的影响

注：不同字母a、b、c、d表示差异显著，P<0.05

2.4 苦参碱对PRRSV/LPS共刺激小鼠脾脏Th17和Treg细胞的影响 在PRRSV和LPS共刺激1 d时，与空白组相比，PRRSV和LPS共刺激组中Treg细胞的表达显著升高(P<0.05)，Th17细胞的表达没有显著变化(P>0.05)；与共刺激组相比，苦参碱处理对Treg和Th17细胞的的表达均没有显著影响(P>0.05)。在7 d时，与空白组相比，PRRSV和LPS共刺激对Th17和Treg细胞的表达没有显著影响(P>0.05)，苦参碱处理后对Th17和Treg细胞的表达没有显著影响(P>0.05)(图4)。

3 讨论

多种病原混合感染是临床上常见的感染模式，临床上PRRSV常与猪圆环病毒、胸膜肺炎放线杆菌和链球菌等病原微生物混合感染，这些混合感染给猪病的防治带来很大的难题[6-8]。已有的研究报道，PRRSV虽然不能在小鼠体内复制，但是却能引起小鼠脾脏的氧化应激反应，IL-10和TNF-α的表达显著升高[13]。本试验通过PRRSV和LPS共刺激昆明系小鼠，结果显示，共刺激诱导更严重的肺脏病理变化，呈典型的间质性肺炎，苦参碱处理后能够改善小鼠的间质性肺炎症状。这些结果提示苦参碱具有抗炎作用，但是其具体的抗炎机制还未阐明。

白细胞、血小板计数与多种疾病活动有关，机体发生炎症或其他疾病时可引起白细胞总数及各种白细胞的百分比发生变化，因此检查白细胞总数及白细胞分类计数成为辅助诊断的一种重要方法[14-15]。血常规检查是目前临床最常用的实验室检测项目之一，本试验通过PRRSV和LPS共刺激昆明系小鼠，血常规检测结果显示，共刺激影响血液中白细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞数，苦参碱处理后能够缓解这种变化。这些结果同时还提示在共刺激早期，LPS在诱导白细胞变化中发挥主要作用，随着刺激时间的延长，PRRSV能够协同LPS诱导的白细胞变化，而苦参碱可调节白细胞含量的变化。

图4 苦参碱对脾淋巴细胞中Th17、Treg细胞的影响

*表示与空白组相比差异显著，P<0.05

炎症是临床最常见的病理过程，炎症因子表达量的变化在炎症反应中发挥重要作用。IL-1β和TNF-α是重要的致炎性细胞因子[16]。已有的研究表明,LPS和PRRSV协同作用显著增加细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌[17]。PRRSV感染可升高RAW264.7细胞以及小鼠脾脏匀浆内TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的水平[13,18]。本试验结果表明，PRRSV和LPS共刺激协同影响TNF-α的表达，LPS影响早期(1 d)IL-1β的表达，PRRSV影响晚期(7 d)IL-1β的表达，而苦参碱在不同刺激时间通过影响TNF-α和IL-1β的表达来抑制PRRSV和LPS共刺激诱导的炎症反应。

Th17细胞(T help cell 17，Th17)和Treg细胞(Regulatory T lymphocyte，Treg)是近年来新发现的CD4+T细胞亚群[20]。近年来研究发现，正常机体内存在着Th17/Treg动态平衡，Th17/Treg失衡可促进自身免疫性疾病炎症反应的发生。研究表明，中药解毒化瘀汤和脾酪氨酸激酶抑制剂均能够通过调节Th17/Treg细胞平衡调节机体炎症反应[19-20]。而本试验的研究结果显示，PRRSV与LPS共刺激仅在1 d时影响Treg细胞的表达；苦参碱处理后对Treg和Th17细胞的表达没有影响，表明苦参碱不通过影响Treg/Th17细胞平衡来抑制PRRSV和LPS共刺激诱导的小鼠炎症反应。与此同时，qRT-PCR检测结果显示,共刺激和苦参碱处理对小鼠脾脏炎症因子IL-1β和TNF-α的表达均没有显著影响(数据未显示)。

综上所述，PRRSV和LPS共刺激诱导小鼠严重的炎症反应，主要表现为典型的间质性肺炎，肺间隔明显增宽、肺泡腔显著缩小等，苦参碱处理后通过影响血液中各种白细胞的表达以及肺脏中IL-1β和TNF-α的表达来抑制炎症反应，改善共刺激诱导的间质性肺炎。