秦皇岛地区育成鸡大肠杆菌血清型鉴定及耐药性分析

李蕴玉，葛 成，焦贺静，王盛达，闫艳娟，李佩国，张召兴，张香斋

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066604)

鸡大肠杆菌病是危害我国养鸡业主要细菌性传染性疾病之一，该病由不同血清型的致病性大肠杆菌引起不同日龄鸡一系列疾病的总称，临床中主要表现败血症、心包炎、肝周炎、气囊炎、滑膜炎、腹膜炎等多种病症，可以通过多种途径感染不同阶段鸡，发病率和死亡率均较高，给我国养鸡业造成严重经济损失[1-2]。大肠杆菌广泛存在环境中，其抗原结构复杂，血清型众多，可以感染家禽、家畜等多种动物及人，是临床中主要人畜共患的条件致病菌[3]。在养鸡过程中，为了防治细菌性疾病，抗菌药物大量的不合理使用，改变了大肠杆菌耐药机制，出现许多耐药菌株，使大肠杆菌对抗菌药物产生很强的耐药性，许多药物由敏感变成耐药，严重影响治疗效果，同时也造成鸡肉、鸡蛋中严重药物残留，威胁人类的健康[4]。本试验从采集的秦皇岛地区患病死亡育成鸡38份肝脏病料组织中分离鉴定出20株大肠杆菌，并对分离的20株大肠杆菌进行血清型检测及耐药性分析，以期为该地区育成鸡的大肠杆菌病预防与治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源 秦皇岛地区患病死亡育成鸡，无菌采集肝脏病料组织38份进行细菌学分离与鉴定。

1.2 主要试剂与仪器 麦康凯培养基、伊红美兰培养基、MH培养基、营养肉汤、革兰染色液试剂盒，均购自青岛高科园海博生物技术有限公司；药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司；生化鉴定试纸条购自法国梅里埃生物股份有限公司；DL-2 000 Marker、2×TaqMarker Mix，均购自北京中科瑞泰生物科技有限公司；大肠杆菌标准O型血清因子购自中国兽医药品监察所；梯度PCR仪，德国eppendorf 公司生产；隔水式恒温培养箱购自上海一恒科技仪器有限公司；ATB自动化微生物生化鉴定系统由法国梅里埃生物股份有限公司生产。

1.3 细菌分离培养鉴定 无菌采集病死雏鸡肝脏组织划线接种于麦康凯培养基上，37 ℃恒温培养12-18 h，挑取优势单个菌落接种于伊红美兰培养基上，37 ℃恒温培养12-18 h。挑取单个菌落接种于营养肉汤中纯化培养，革兰染色镜检观察细菌形态。

1.4 生化试验鉴定 将纯化培养的分离菌调整为0.5麦氏浊度，接种于肠杆科生化鉴定试纸条中，37 ℃恒温培养24-48 h后，按照说明书操作，并用用ATB自动化微生物生化鉴定系统对分离菌株生化特性鉴定。

1.5 细菌的16S rRNA PCR扩增及测序 按参考文献[5]设计细菌16S rRNA序列，5′-CCGTCTTCAGTTCCAGTGTG-3′/5′-GTGGCGGACGGGTGAGTAA-3′由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用水煮方法提取细菌DNA组，进行PCR鉴定。PCR扩增反应体系为50 μL：2×TaqMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 18 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性50 s，58.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃延伸10 min。取出5 μL扩增产物用1%琼脂糖凝胶检测目的条带，将PCR产物进行序列测定，测序结果与GenBank数据库中登录基因序列进行同源性分析。

1.6 细菌的血清型检测 按参考文献[6]，将20株分离菌株121 ℃灭菌2 h，破坏其K抗原，用大肠杆菌标准O型血清因子进行玻板凝集试验，检测分离菌株的血清型。

1.7 药敏试验 参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的标准K-B纸片法进行试验操作和结果判断，分别用敏感(S)、中度敏感(I)、耐药(R)表示。将20株分离菌株调整0.5个麦氏浊度，均匀涂抹在MH培养基上，待菌液完全吸收后，贴上药敏纸片，37 ℃恒温培养12-18 h，测量抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养结果 将38份肝脏病料组织进行细菌分离鉴定，其中20株分离菌株均在麦康凯培养基上长出圆形的、边缘整齐的、大小一致的桃红色菌落；在伊红美蓝培养基上长出圆形、带有金属光泽黑色或者褐色的菌落；革兰染色镜检，分离菌株为两端钝圆、杆状菌的革兰阴性菌，与报道的大肠杆菌培养特性和形态学观察一致。

2.2 生化鉴定结果 20株分离菌株均发酵甘露醇、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖，能产酸不产气，不分解尿素；V-P试验均为阴性，吲哚试验均为阳性。用ATB全自动生化鉴定系统鉴定结果均为大肠杆菌，评定结果合格率为99.8%～99.9%。

2.3 细菌的16S rRNA扩增与测序结果 20株分离菌株用细菌的16S rRNA的通用引物，均扩增出1 492 bp的目的条带(图1)；其测序结果与GenBank登录的12株大肠杆菌参考菌株的同源性在98.9%～99%之间，从分子生物学角度证实了20株分离菌株为大肠杆菌。

图1 部分分离菌株16S rRNA PCR扩增结果

M:DL-2 000 Marker; 1～13:分离菌株；14:空白对照

2.4 细菌的血清型检测结果 20株大肠杆菌分离菌株属于5种血清型，以O1、O2、O78、O18、O89型分别占40.0%、30.0%、15.0%、10.0%、5.0%。

2.5 耐药性分析结果 由表1可知，20株分离菌株对磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、林可霉素4种药物耐药性最高，耐药率为100%；对头孢拉啶、复方新诺明、青霉素、土霉素、氨苄西林、新霉素6种药物耐药率在75.0%～95.0%之间；对氧氟沙星、恩诺沙星、头孢曲松、大观霉素、氟苯尼考、卡那霉素6种药物耐药性在50.0%～65.0%；对其他药物的耐药率在5.0%～40.0%之间。

表1 20株大肠杆菌耐药性分析结果

由图2可知，20株大肠杆菌分离株4重以上耐药菌株占100%，其中耐4、5、7、9、16、17、20种抗生素菌株各1株，占分离菌株的5.0%，耐12、14、15、18、19种抗生素菌株各2株，占分离菌株的10.0%，耐13种抗生素菌株3株，占分离菌株的15.0%。

图2 20株大肠杆菌分离菌多重耐药性分析结果

3 讨论

根据大肠杆菌的遗传特点和临床症状可以分为肠道外致病性大肠杆菌、肠道内致病性大肠杆菌、共生型大肠杆菌3个类型，其中肠道外致病性大肠杆菌和肠道内致病性大肠杆菌是引起多种动物及人类发病的主要大肠杆菌类型，尤其肠道外致病性大肠杆菌可以引起肠道以外器官感染，严重者可导致败血症等全身感染，鸡的致病性大肠杆菌属于肠道外致病性大肠杆菌[4]。大肠杆菌为环境中条件致病菌，其基因组复杂并携带多种毒力基因，该菌因携带毒力基因而产生很强的致病性，并且感染途径广泛，尤其当外界条件改变时，导致动物免疫力下降，可以引起该病发生与流行，另外一些病毒性疾病也可以继发该病的发生。大肠杆菌血清型众多复杂，不同地区流行血清型也不同，其致病性也存在一定的差异性。本试验从秦皇岛采集的38份病死育成鸡病料组织中分离到20株大肠杆菌，分离率52.6%(20/38)，分属于5种血清型，以O1和O2为主要流行血清型。

大肠杆菌不同血清型菌株因缺乏交叉免疫保护性，给疫苗研制带来了一定困难。故抗菌药物成为防治鸡大肠杆菌病主要方法。在养鸡过程中由于抗菌药物不合理的使用，致使大肠杆菌产生很强的耐药性。相关研究表明，鸡大肠杆菌携带耐药基因或者耐药质粒通过多种途径转移到人的体内，可以产生相同的耐药性，威胁着人类的健康[7]。本试验结果显示，20株大肠杆菌分离菌株对磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、阿莫西林、林可霉素4种药物耐药率为100%，对头孢拉啶、复方新诺明、青霉素等12种药药物耐药率在50.0%～95.0%之间，4重以上耐药菌株占100%。该结果与毛福超等[8]、舒刚等[9]、杨盛智等[10]报道存在一定的差异性，可能与地区的血清型、抗生素使用的种类及剂量有关。因此，当发生该病时，应通过药敏试验选择高敏药物，以提高治疗效果，减少耐药性的产生。同时要加强平时的饲养管理，注意养殖环境中的消毒。