牡蛎酶解工艺及其药理活性研究进展

□ 蔡树杏 广州白云山和记黄埔中药有限公司现代中药研究院

王锦旭 韩山师范学院食品工程与生物科技学院 中国水产科学研究院南海水产研究所农业农村部水产品加工重点实验室

1 前言

牡蛎俗称蚝或海蛎子，因肉质鲜美可口而受到人们的喜爱，具有很高的药用价值，并且含有丰富的蛋白质和碳水化合物，因其锌含量极高，富含铁、钙等元素。根据相关研究报道，牡蛎多糖、多肽具有较高的生物活性，牡蛎多糖、多肽的提取方法有碱提取法、酸提取法、蛋白酶水解法等。碱提取法和酸提取法的条件较为剧烈，且无选择性，所以近年来酶提取工艺得到较好发展。由单一酶解法，到多种酶复合酶解，再到多种酶分步酶解、酸酶结合酶解、多糖多肽联产加工，其目的都是得到不同分子量的不同生物活性成分，或者降低生产成本，总之，酶解技术的发展为研究牡蛎活性成分、活性作用提供了一种高效的途径。

2 酶解工艺

研究牡蛎酶解技术，一是为了获得营养更加丰富、味道更加鲜美的调味品。二是为了寻找具有生物活性作用的多糖或者多肽。酶解工艺条件包括酶的种类，添加的数量、顺序，酶解时间等，不同的酶解技术得到的酶解产物不同，分子量和结构都存在差异，酶解的程度也不一样，所得产物的风味和活性作用也存在差异。从酶解技术的发展来说，复合酶解、多步酶解可以得到酶解程度更高、目标分子量更为精准、活性更高的产物。

2.1 单一酶酶解

王长伟[1]等以新鲜无壳牡蛎为原料，采用胰酶酶解的方法制备牡蛎活性肽，经膜分离后得到均分子量为750 Da的活性肽。赵荣涛[2]等利用化学方法分别评价9种酶对牡蛎蛋白酶解多肽的降血糖和抗氧化活性的影响，发现经风味蛋白酶酶解得到的多肽抗血糖升高作用较强，糜蛋白酶酶解得到的多肽抗氧化作用较强。张雪妍[3]等利用木瓜蛋白酶对牡蛎进行酶解，得到质量浓度为14.95 mg/mL的酶解液。徐慧[4]等利用纳豆芽孢杆菌对牡蛎边角料进行酶解，发现纳豆芽孢杆菌可以用于牡蛎的发酵。许庆陵[5]等利用Alcalase碱性蛋白酶水解牡蛎，制备牡蛎水解蛋白，得到水解度为40.38%的牡蛎多肽。冯丹丹[6]等研究了4种蛋白酶对牡蛎的酶解作用，发现枯草杆菌中性蛋白酶的水解程度最高，其次为风味蛋白酶，木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的水解程度较低。

2.2 复合酶酶解

刘海梅[7]等采用Protemax复合蛋白酶水解牡蛎肉，得到水解度为27.28%的牡蛎多肽。姚玉静[8]等选用胰蛋白酶和风味蛋白酶深度酶解牡蛎，发现牡蛎深度酶解的最优工艺条件为胰蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为2∶1，该条件下得到的牡蛎深度酶解产物中分子量小于3 ku的多肽达到83.5%。张典[9]等采用胰蛋白酶和风味蛋白酶协同酶解牡蛎，得到的蛋白质水解度和蛋白回收率分别为37.82%和71.87%。李园[10]等用无花果蛋白酶和风味蛋白酶水解牡蛎肉制备抗氧化酶解液，发现无花果蛋白酶与风味蛋白酶的比例为5∶1（质量比）时，该酶解液具有较高的抗氧化活性和蛋白质回收率。

2.3 多种酶分步酶解

邱娟[11]等利用复合蛋白酶和碱性蛋白酶分步酶解牡蛎，制备得到纯度为99.72%分子质量小于3 000 Da的具有ACE抑制作用的活性肽。胡雪琼[12]等比较了木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶不同组合的酶解效果，发现先用枯草杆菌中性蛋白酶，再加胰蛋白酶对牡蛎进行程序酶解，可得到牡蛎糖胺聚糖含量为2.40%的粗提物。方富永[13]等利用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶3种酶依次对牡蛎进行酶解，得到相对分子质量（Mr）在300～1 000的多肽。

2.4 酸酶结合水解

因为单纯酶解成本太高，酸水解成本低但无选择性，为了酶解彻底，且节约成本，杨留明[14]等利用酸酶结合法水解牡蛎肽，即先用醋酸酸解，选择胰蛋白酶与风味蛋白酶（质量比为2∶1）酶解，得到水解度为36.25%±0.63%的牡蛎肽。

2.5 多糖多肽联产加工技术

为了综合开发利用牡蛎多糖、多肽，杨大俏[15]等利用Alcalase酶、胰蛋白酶结合膜过滤，同时提取、分离牡蛎多糖和多肽，实现了牡蛎多糖及多肽的联产技术。

3 酶解产物的活性作用

3.1 免疫调节作用

许丹[16]等研究发现牡蛎肽可改善CTX所致免疫低下小鼠免疫器官结构紊乱，恢复CTX造成的小鼠T淋巴细胞比例失调及细胞因子紊乱，升高骨髓有核细胞数及骨髓DNA含量，从而增强机体免疫功能。李婉[17]等研究发现牡蛎酶解产物可提高脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞的免疫功能，且小于2.5 kDa组分和2.5～5 kDa组分的免疫功能优于其他组分。胡雪琼[18]等采用小鼠体内注射环磷酰胺（CTX）法建立免疫抑制动物模型，牡蛎糖胺聚糖对正常小鼠免疫器官指数、抗体生成数和血清溶血素、细胞免疫、单核巨噬细胞、NK细胞杀伤活性的均有显著影响,表明其具有免疫增强功能。陈晓文[19]等研究发现牡蛎肽可以增加免疫器官的相对重量和血清溶血素含量，并能显著增加抗体生成细胞和迟发型变态反应。刘淑集[20]等研究认为牡蛎寡肽能够显著提高脾淋巴细胞的增殖能力、NK细胞活性、廓清指数K、吞噬指数a、吞噬中性红能力、TNF－α、IL－6、溶血素水平和改善脾淋巴细胞CD3+4T淋巴细胞亚群及CD3+8T淋巴细胞亚群分布（P＜0.05），而对小鼠的肝、脾脏指数影响不显著。

3.2 抗病毒作用

李江滨[21]等采用血凝滴度测定牡蛎多糖对流感病毒在狗肾细胞（MDCK）中增殖的抑制作用，结果表明牡蛎多糖能显著降低和抑制狗肾细胞培养流感病毒的血凝滴度。李萌[22—23]等研究发现，牡蛎糖胺聚糖（O—GAG）能显著降低Ⅰ型单纯疱疹病毒（HSV—1）感染小鼠的死亡率，延长其存活时间，并明显提高病毒感染小鼠的胸腺指数和脾指数，增强巨噬细胞吞噬能力，从而对感染Ⅰ型单纯疱疹病毒的小鼠具有一定的治疗作用，并能提高小鼠的免疫功能。

3.3 降血糖、血压

王海桃[24]等研究了牡蛎提取物牡蛎糖胺聚糖对过氧化氢诱导的血管内皮细胞氧化损伤模型的影响发现，牡蛎糖胺聚糖对过氧化氢诱导的血管内皮细胞氧化损伤有保护作用，能有效防止因血管内皮损伤而引起的高血压、动脉硬化、脑卒中等多种心血管疾病。邱娟[11]等研究发现分子质量在3 000Da以下的牡蛎肽具有ACE抑制活性，其IC50为0.8 mg/mL，因此，牡蛎多肽具有降血压作用。欧成坤[25]等研究认为牡蛎经酸性蛋白酶酶解得到的产物在ACE抑制活性、清除羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH·自由基方面均优于或近似于Aclalase碱性蛋白酶酶解产物。赵荣涛[2]研究发现风味蛋白酶酶解得到的牡蛎多肽对α—淀粉酶的抑制效果最好，多肽浓度为5 mg/mL时抑制率达到67.13%，IC50值为3.806 mg/mL。

3.4 抗癌作用

李鹏[26]等用牡蛎活性肽，对人胃癌BGC—823细胞凋亡的生物学效应及其对胃癌细胞的作用做了研究。结果显示，牡蛎活性肽能有效抑制胃癌BGC—823细胞的增殖活动，出现亚G1期细胞，细胞进入凋亡状态，表明其具有显著的诱导凋亡作用。胡雪琼[12]等采用四氮唑蓝还原法（MTT法）研究牡蛎糖胺聚糖对人宫颈癌细胞（Hela细胞）的体外抗肿瘤活性，结果显示500 μg/mL 剂 量 组 与 600 μg/mL 剂量组48 h时的抑制率分别为43.1%（P＜0.05），55.8%（P＜0.05），因此近江牡蛎糖胺聚糖具有较明显的抗肿瘤活性。

3.5 抗氧化

赵荣涛[2]等研究院发现，糜蛋白酶酶解得到的牡蛎多肽对超氧阴离子的抑制率最高，2 mg/mL时抑制率为53.64%，IC50值为1.75 mg/mL。魏颖[27]等研究认为牡蛎肽主要含有相对分子量低于1 000 U的八肽以下的短肽，该短肽具有抑制细胞内ROS生成的能力，并对ConA诱导的T—淋巴细胞增殖有抑制作用。李茹[28]等研究发现用碱性蛋白酶酶解得到的牡蛎多肽具有最强的DPPH·自由基清除能力，其浓度为1 mg/mL时清除率最大。

3.6 抗衰老

李大炜[29]以不同剂量的牡蛎肽给大鼠灌胃4周，观察各组间睾丸组织形态、生化指标及精子质量等差异，发现牡蛎肽能修复D—半乳糖致衰老大鼠睾丸组织的衰老形态；提高精子质量、干细胞因子浓度。张雪妍[3]等研究认为木瓜蛋白酶酶解得到的牡蛎多肽＜5 ku和5～10 ku超滤组分细胞增殖活性及促进睾酮分泌的活性均最强。