工程大肠杆菌异源表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的诱导工艺研究

彭 超陈 博李 义45佟 毅45

(1.中粮营养健康研究院有限公司，北京102209；2.营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京 102209；3.老年营养食品研究北京市工程实验室，北京 102209；4.中粮生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233010；5.玉米深加工国家工程研究中心，吉林 长春 130033)

D-阿洛酮糖是D-果糖在C-3的差向异构体，是自然界中存在含量极少的一种稀有单糖，具有极低的热量值，与蔗糖甜度相似，但吸收率仅为蔗糖的0.3%，故可以替代蔗糖作为低热甜味剂，而且研究表明D-阿洛酮糖具有多种营养学和生理学功能[1-3]。但是，D-阿洛酮糖的化学合成比较困难，以钼酸盐为催化剂，反应温度维持在80～120 ℃，过程副产物较多[4]，目前尚未有突破性进展。生物转化方法单一，纯化步骤简单，受到科研人员的重点关注，利用微生物途径和酶催化转化法生产D-阿洛酮糖是目前的主流研究方向，而DPEase酶可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化，利用D-果糖生产D-阿洛酮糖[5-6]。

笔者以中粮营养健康研究院构建的高效表达DPEase酶的工程大肠杆菌为研究对象，在5 L发酵罐中考察诱导时间、诱导温度、诱导pH和诱导剂用量对大肠杆菌生长和蛋白酶表达的影响，确定了大肠杆菌异源表达DPEase酶的较优诱导条件，为进一步研究D-阿洛酮糖的生物转化提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 菌 株

工程大肠杆菌NHRI-Ec01，中粮营养健康研究院实验室构建并保藏，卡那霉素抗性。

1.2 菌种培养基

种子培养：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L。

发酵培养基：磷酸二氢钾9 g/L，磷酸氢二铵4 g/L，无水柠檬酸1.7 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，七水硫酸镁0.6 g/L，维生素B1 0.004 5 g/L，消泡剂0.1 g/L，微量元素1 mL/L，25%氨水溶液调节pH至7.0±0.1。

微量元素：EDTA 0.72 g/L，六水氯化钴0.25 g/L，四水氯化锰1.5 g/L，五水硫酸铜0.22 g/L，硼酸0.3 g/L，钼酸铵0.182 g/L，硫酸锌1.7 g/L，五水柠檬酸铁铵17.58 g/L，浓硫酸1 mL，去离子水1 L。按配方配好后在超净台用0.22 μm无菌过滤膜过滤，装入无菌棕色瓶避光4 ℃保存。

补料培养基：葡萄糖600 g/L，无水柠檬酸15 g/L，七水硫酸镁2 g/L。

1.3 仪器与设备

Y-1200型可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；SW-CJ-1FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；Milli-Q超纯水仪，美国密理博有限公司；ZQZY-CF8振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；1-14小型台式离心机，Sigma；1260 infinity高效液相色谱仪，Agilent Technologies；SBA-40E生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所；BioFlo 115发酵罐，New Brunswick；LX-600冷却水循环装置，YKKY；750-30无油空气压缩机，上海捷豹压缩机制造有限公司。

1.4 培养方法

1.4.1 种子培养

工程大肠杆菌NHRI-Ec01的甘油管菌种保藏于-80 ℃冰箱内待用。取甘油管内200 μL菌悬液接入装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃，200 r/min条件下在恒温振荡培养箱内培养16～17 h后得一级种子液，种子液OD600达到3.0以上。

1.4.2 发酵罐发酵

新鲜种子液按体积分数5%的接种量接入灭菌并冷却后的5 L发酵罐中，培养液的初始体积为3 L，卡那霉素抗性加至质量终浓度为50 μg/mL。初始培养温度为37 ℃，初始通气比为1 m3/(m3·min)，25%氨水调节pH在6.8～7.2，初始糖耗尽后，采用补料-溶氧联动方式控制补料培养基流加速率，使得发酵液中残糖含量恒定维持在较低水平(小于1.0 g/L)，溶氧(Dissolved oxygen,DO)与转速级联，并控制DO在25%左右，发酵液OD600达到一定水平后，调整发酵温度和pH至不同水平，添加一定量的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。

1.5 检测方法

1.5.1 菌体量测定

将发酵液按照一定倍数稀释，直至在600 nm波长处的吸光值介于0.3～0.7，测量600 nm下的吸光值，乘以稀释倍数即为菌体量(OD600)。

1.5.2 残糖测定

取新鲜均一发酵液，以12 000 r/min高速离心，收集上清液，稀释至可检测范围，SBA-40E型生物传感器进行分析检测。

1.5.3 DPEase酶浓度测定

安捷伦HPLC 1260化学工作站，色谱柱为waters sugar-Pak I，规格为10 μm ×6.5 mm×300 mm，示差折光检测器RID，检测器温度55 ℃，进样量10 μL，以脱气超纯水作流动相，流速为0.4 mL/min，柱温为85 ℃。

样品的测定：发酵液离心收集菌体后，无菌生理盐水重悬至OD600值为100，60 MPa压力下均质机处理2～3次，细胞破碎液经离心得到澄清酶液。新鲜酶液经稀释后，与30%质量浓度的果糖葡萄糖混合液按体积比1∶20混合，55 ℃条件下反应5 min。反应后的样品在100 ℃条件下高温煮10 min以终止酶反应。酶反应产物低温离心，上清液用0.22 μm微滤膜过滤处理，稀释后进行HPLC检测。

假设标准曲线方程为Y=AX+B，Y为峰面积，由液相检测可得，A和B分别代表标准曲线的斜率和截距，X为D-果糖浓度，由标准曲线方程式计算可得。平衡转化率计算公式为

式中：X1为各样品的D-果糖浓度；X2为空白对照的果糖浓度。

2 实验设计与结果分析

2.1 工程大肠杆菌NHRI-Ec01的生长曲线测定

按1.4.2描述的方法进行5 L发酵罐培养(未诱导无补料)，每隔2～4 h取样测定OD600，并绘制出NHRI-Ec01菌株在5 L发酵罐培养的生长曲线如图1所示。

图1 工程菌在5 L发酵罐中生长曲线Fig.1 The growth curve of engineering bacteria NHRI-Ec01 in 5 L bioreactor

由图1可知：培养6 h，菌体生长进入指数期(OD600为3.59)，16 h进入稳定期(OD600维持在35～37)。若进一步延长周期，菌体会因为营养缺陷而进入衰亡期。指数生长期中期，菌体生长最为活跃，对外界环境最为敏感[7-8]，因此将指数生长期中期(6～12 h)作为NHRI-Ec01菌株的最佳诱导时机。

2.2 诱导温度对工程菌生长和DPEase酶平衡转化率的影响

异源蛋白的表达很大程度上会增加宿主菌株的负担，影响自需蛋白的正常表达，蛋白质三维结构的正确折叠才是功能蛋白的合成基础。通过降温处理，可减缓多肽合成速率，为肽链正确空间折叠预留充足时间，避免形成无生物活性的包涵体结构[9-10]。本实验按照1.4.2描述的方法进行5 L发酵培养，初始温度固定37 ℃，从指数期中期开始，培养温度分别降至30，25，20 ℃，待温度稳定后进行IPTG诱导，以考察诱导温度对工程菌生长和DPEase酶表达的影响。发酵结果及酶活转化率数据如图2，3所示。

图2 诱导温度对工程大肠杆菌生长的影响Fig.2 Effect of induction temperature on biomass growth and DPEase conversion rate

图3 诱导温度对DPEase酶平衡转化率的影响Fig.3 Effect of induction temperature on DPEase conversion rate

由图2可知：菌种活力旺盛，接种量合理，没有明显的延滞期，发酵6 h生长曲线已经达到指数中期，分别降温至不同水平并诱导后，菌体生长速率不同程度受影响，其中20 ℃诱导后的菌体生长速度影响最小，最高菌体OD600为62，可能是因为异源蛋白正确折叠，菌体负载压力变化不大，而继续保持较高温度，形成包涵体沉淀的蛋白越多(蛋白胶图未提供)，不可溶性错误蛋白的积累不利于菌体生长，诱导18 h后发酵结束。

由图3可知：低温诱导表达的DPEase酶平衡转化率最高，接近24%，尽管离文献报道的最大转化率64%相差甚远[11]，但基本可以证明低温诱导的优越性。另外，低温发酵往往会增加冷却机组的能耗，加重企业运行成本，而图3同样揭示了不同温度诱导后的平衡转化率差异不大。基于此，该工程菌的最佳诱导温度可以因季节和区域的不同，选定20～30 ℃比较适宜。

2.3 pH对工程菌生长和DPEase酶平衡转化率的影响

蛋白质的四级结构同样受外界环境pH的影响。蛋白质一级结构是正确翻译的氨基酸序列，序列中酸性氨基酸和碱性氨基酸的数量不同，影响到肽链或者蛋白质的等电点；同时，维持蛋白质二级和三级结构的氢键和静电作用也受环境pH的影响[12-13]。本实验按照1.4.2描述的方法进行5 L发酵培养，初始pH 7.0，培养至指数中期后降温至25 ℃，并分别调整pH为6.6，7.0，7.4，待温度和pH稳定后进行IPTG诱导，诱导时长超过18 h，以考察不同诱导pH对工程菌生长和DPEase酶表达的影响。发酵结果及酶活转化率数据如图4，5所示。

图4 诱导pH对工程菌生长的影响Fig.4 Effect of induction pH level on biomass growth

图5 诱导pH对不同时间点相应DPEase酶的平衡转化率的影响Fig.5 Effect of induction pH level on DPEase conversion rate at different time

图4，5分别了揭示了诱导pH对该工程菌生长和DPEase酶活性的影响。由图4，5可知：诱导之前，发酵罐之间的生长平行性良好，降温调pH后，相对来说，碱性环境对生长的影响较为明显，稳定平台期的生物量比其他两组低16%～19%，推断是过量氨水中和了中间代谢有机酸，对有机酸的传递与供应产生了竞争抑制。控制pH为6.6时，发酵稳定平台期的OD600比pH 7.0方案稍高，说明该改造菌株适应于中性和偏酸性环境，与文献报道的工程大肠杆菌异源表达类人胶原蛋白生长最适pH接近[14]。

对于DPEase酶的表达，发酵终点DPEase酶的平衡转化率受pH影响变化不大，均在28%左右，但是相对于其他2组，pH 7.0恒定方案在发酵周期控制上有明显优势，在诱导12 h、发酵18 h就可以达到最高的平衡转化率，发酵周期压缩25%，恒定pH亦不会额外增加酸碱用量。因此，选择pH 7.0作为诱导pH。

2.4 诱导剂用量对工程菌的生长和DPEase酶表达的影响

Lac操纵子来源的启动子经常被用于原核表达系统(如大肠杆菌)的启动表达，乳糖及类似物作为诱导剂，IPTG被认为是一种高效的非代谢性分子生物学诱导剂，但IPTG价格昂贵，诱导剂成本往往成为最大的原料成本[15]，甚至可以决定一个工程菌产业化项目的利润率高低，因此合适的诱导剂用量，即可以保证异源蛋白的有效表达，又可以避免高价IPTG的浪费。

本实验按照1.4.2描述的方法进行5 L发酵培养，初始pH7.0，培养至指数中期后降温至25 ℃，并维持pH为7.0，待温度和pH稳定后进行IPTG诱导，诱导剂的终浓度分别为0.2，0.5，1.0 mmol/L。诱导时长18 h，以考察不同诱导剂用量对工程菌生长和DPEase酶表达的影响。发酵结果及酶活转化率数据如图6，7所示。

图6 诱导剂用量对工程大肠杆菌生长的影响Fig.6 Effect of terminal concentration of IPTG on biomass growth

图7 诱导剂用量对DPEase酶平衡转化率的影响Fig.7 Effect of terminal concentration of IPTG on DPEase conversion rate

由图6，7可知：诱导剂的影响非常显著，其中图6比较了诱导前后的生长趋势，图7显示最适诱导剂浓度为0.5 mmol/L。IPTG作为一种强效诱导剂，对菌体具有一定的毒性，瞬间的浓度过高，导致异源蛋白非正常折叠的概率增加，非可溶性蛋白进一步增加了菌体的生长负担，发酵中后期菌株逐渐适应，表现出轻微增长，低浓度的诱导剂收获最高的生物量。对于DPEase酶的平衡转化率，IPTG的终浓度符合0.1～1.0 mmol/L的经验范围[16]，且在实验范围内，平衡转化率先增后降，IPTG终浓度为0.5 mmol/L时对应的平衡转化率最高，达到27.6%。

3 结 论

对基因工程菌株进行诱导培养的目的在于提高目的蛋白的表达产量，降低成本。目的基因的表达量，除了受菌株自身因素和质粒稳定性的影响外，还受诱导工艺的影响，因此探索一套最优的诱导工艺至关重要[17]。本研究系统考察了工程大肠杆菌NHRI-Ec01诱导表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的最优条件，经验证，生长初期温度为37 ℃，指数中期(6 h)开始降温至25 ℃，pH恒定7.0，待温度和pH稳定后，一次性加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导剂，诱导时长18 h，该工程大肠杆菌发酵生产DPEase酶的平衡转化率可达到28%，达到已公开报道的平均水平[5]。该诱导工艺同时兼顾能耗成本和发酵周期，为项目的下游工艺探索和提升提供了一定的参考依据。