Box-Behnken响应面法优化满山红油自乳化释药系统研究 *

★ 陈宇悍 闫鹏举 张菁楠 于莲 苏瑾 *

(佳木斯大学药学院黑龙江省生物药制剂重点实验室 黑龙江 佳木斯154007)

满山红油是杜鹃花科植物兴安杜鹃(RhododendrondauricumL.)的叶经水蒸气蒸馏提取的挥发油，其味辛、苦，性寒，有文献报道，满山红油具有止咳、祛痰的功效，用于急、慢性支气管炎，疗效高、副作用小，其主要成分有杜鹃酮、葎草烯、石竹烯等[1]。已报道的满山红油制剂有片剂(如消咳喘片)、胶囊剂(复方满山红胶囊)、滴丸剂等，常规的制剂方法容易造成挥发油成分的散失，且因其气味，服用后容易引起胃肠道不适。

自乳化释药系统(self-emulisifying drug delivery systems, SEDDS)由药物、油相、表面活性剂和辅助表面活性剂形成的口服固体或液体给药系统，乳化所需要的自由能低，体系在体外37 ℃水浴、温和搅拌下或在胃肠道蠕动下，能自发形成粒径小于500 nm的水包油型乳剂[2]。采用自乳化释药技术对满山红油进行制剂设计，利用有效成分存在于细小的油滴中，可从胃中迅速排空的特点，使药物在整个胃肠道中广泛分布，显著提高药物的生物利用度，还可克服普通乳剂服用体积大、稳定性不易控制等缺点，为提高满山红治疗慢性支气管炎的临床效果提供一个更有效的途径。

本实验通过溶解度实验、正交试验和伪三元相图的绘制，采用Box-Behnken响应面法优化满山红油自乳化系统处方，以乳化时间和乳滴的有效粒径为指标，对处方中的油相、乳化剂的用量配比进行筛选，选出最优处方及质量比，为制备满山红油临床应用新剂型提供参考。

1 材料

1.1 试药 满山红油(江西恒诚天然香料油有限公司，批号20180101)；聚氧乙烯蓖麻油(EL-40，德国BASF公司)聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH-40，德国BASF公司)；吐温-80(Tween 80，天津市大茂化学试剂厂)；肉豆蔻酸异丙酯(IPM)，辛酸/癸酸甘油三酯(GTCC)(临沂市兰山区绿森化工有限公司)；大豆油(中粮集团有限公司)。

1.2 仪器 Malvern Zetasizer Nano ZSE 纳米粒度电位仪(英国马尔文公司)；XW-80A涡旋仪(上海精科实业有限公司)；80-2离心机(上海浦东物理化学仪器厂)；98-1-B型电子恒温加热套(天津市泰斯特仪器有限公司)

2 方法与结果

2.1 溶解度实验 取1 mL满山红油，置于具塞离心管中，分别与1 mL大豆油、辛酸/癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、吐温-80混合，涡旋混匀3 min后，于4000 r·min-1离心3 min，观察满山红油在其中的溶解情况[3]。由实验观察到，辛酸/癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯和大豆油均可与满山红油相混溶，可作为油相。满山红油在吐温-80、聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯氢化蓖麻油中皆能均匀溶解分散，呈黄色澄明液，高速离心无分层，也无析出物，所以吐温-80、聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯氢化蓖麻油可用作满山红油处方表面活性剂。

2.2 处方中辅料的筛选 通过正交试验筛选处方，根据体外乳化试验结果，确定油相及表面活性剂。如表1所示，以油相(A)和表面活性剂(B)作为考察的2个因素，选用辛酸/癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯和大豆油，以及吐温80、聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯氢化蓖麻油分别作为2个因素的3个水平。自乳化制剂处方中油相比例一般为35%～70%(质量分数)，表面活性剂比例为30%～60%(质量分数)，口服SEDDS处方油相和表面活性剂的经典配比为质量比7∶3[4]，按照m(挥发油)∶m(油相)∶m(表面活性剂)为200 mg∶350 mg∶150 mg设计正交实验，通过观察乳液的外观、析油量、是否乳化以及乳化时间进行评价，利用正交设计表对处方进行筛选。

根据正交表分别配制出9组溶液，依次取样于离心管中，涡旋混匀后，观察溶液是否分层，然后转移至盛有37 ℃、50 mL蒸馏水烧杯中，用玻璃棒缓慢搅拌，观察乳化效果。其未乳化的油量以水层上飘浮的油的面积来确定。

表1 正交水平设计表

表2 正交试验筛选结果

注：乳液析油量：-未析出，+<25%，++<50%，+++<75%，++++<100%。

结果显示，油相为肉豆蔻酸异丙酯时较容易被乳化，得到的乳化效果最好，且与其他表面活性剂混合时稳定、不分层，大豆油很难被乳化，乳液析油量大且有明显的分层现象。表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油时乳化能力最强，吐温-80次之，聚氧乙烯氢化蓖麻油最弱。第8组处方形成的乳剂澄清透明，有乳光，乳化效果较其他组理想。因此最优的处方中油相为肉豆蔻酸异丙酯，表面活性剂为聚氧乙烯蓖麻油。以伪三元相图进一步确定自乳化配比。

2.3 伪三元相图的绘制和最佳处方比例筛选 确定满山红油SEDDS处方的辅料后，将油相与乳化剂按照9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的质量比分别混合均匀[5]，将满山红油加入，使每一份混合体系中满山红油的质量分数分别为45%、30%、15% 和0% 制备多个自乳化样品。对上述自乳化样品的乳化效果、乳液的稳定性进行体外评价，并通过纳米粒度仪测定乳滴的粒径大小。符合要求的自乳化样品有如下特征：样品很快溶解于水，形成的乳液呈白色或澄明，不析油、不分层，粒径≤ 0.5μm、且分布均匀[6]。用origin 8.0绘制满山红油SEDDS的伪三元相图[7]，结果见图1。

图1 满山红挥发油、聚氧乙烯蓖麻油、肉豆蔻酸异丙酯的伪三元相图

阴影部分为自乳化区，可以看出，满山红挥发油、肉豆蔻酸异丙酯和聚氧乙烯蓖麻油的质量分数范围分别为0%～45%，7%～60%，25.5%～63%，当处方三相的质量分数位于伪三元相图的成乳区域之内时，都可以形成乳化效果较好的自乳化剂。

2.4 Box-Behnken响应面法优化处方 选取满山红油(X1)、油相(X2)与乳化剂(X3)作为考察因素，以中位粒径大小(Y1)、自乳化时间(Y2)作为响应值，采用Box-Behnken法优化工艺，优化满山红油自乳化系统处方。试验中每个因素的3个水平分别记为-1、0、+1(表3)。

2.4.1 考察因素对粒径的影响

应用Design-Expert trial version 8.0.6对表5中的数据进行分析。考察因素对效应值1(中位粒径)的影响结果见表5。由表5可知，预测模型的P<0.0001，模型显著。失拟项P=0.2502，大于0.05说明模型对真实情况的模拟是准确的，综合来看该预测模型可以用于满山红油自乳化处方的优化。因素A的P=0.0002，因素B、C的P值 <0.0001，说明满山红油，IPM，EL-40对粒径有很显著的影响[8]。

表3 Box-Behnken 响应面法优化处方

表4 BBD设计与结果

表5 自乳化粒径回归模型系数的显著性检验结果

注:*P<0.05，**P<0.01。

拟合得到二次回归方程为：Y1=100.66+21.18 A+44.70 B-39.81 C+8.23 AB-10.92 AC-21.37 BC-1.59 A2-8.85 B2+0.76 C2。方程拟合后的结果显示，其相关系数 r2=0.9849，预测模型可靠，可以很好地描述出实验的真实情况，采用该方程代替真实的实验点进行分析，能真实反映实验结果[9]。

图2表示的响应面图显示不同的独立变量对满山红油自乳化处方粒径的影响，结果表明，随着EL-40用量的升高，粒径逐渐减小；随着满山红油和IPM用量的升高，粒径逐渐增大。

图2 粒径的响应面三维图

2.4.2 考察因素对乳化时间的影响

表6 自乳化乳化时间回归模型系数的显著性检验结果

注:*P<0.05，**P<0.01。

应用Design-Expert trial version 8.0.6对表6中的数据进行分析。考察因素对效应值2(乳化时间)的影响结果见表6。由表6可知，预测模型的P<0.0001，模型显著。失拟项的P=0.4181，大于0.05，能准确地模拟出实验的真实情况，综合来看该预测模型可以用于满山红油自乳化处方的优化。因素A的P=0.0001，因素B、C的P值均小于0.0001，说明满山红油，IPM，EL-40对乳化时间的影响都很显著。

拟合得到二次回归方程为：Y2=21.17+2.66 A+6.37 B-5.46 C+2.66 AB-5.18 AC-5.42 BC+0.25 A2-1.09 B2+2.85 C2。方程拟合后的结果显示，其相关系数 r2=0.9923，预测模型可靠，能很好地描述真实情况，使用该方程代替真实的实验点进行分析是可行的，能真实反映实验结果。

图 3 表示的响应面图显示不同的独立变量对满山红油自乳化处方对乳化时间的影响，结果表明，随着满山红油和IPM用量的增加，乳化时间逐渐增大；随着EL-40用量的增加，乳化时间逐渐减小。

图3 乳化时间的响应面三维图

2.5 Box-Behnken 响应面优化与分析 根据多项式方程，分别绘制各指标与响应值交互项的响应面曲面图，确定各因素对满山红油自乳化处方的影响。通过 Design Expert 8.0.6 软件进行拟合作图，所得响应面图和等高线图，可直观地反映各个因素和响应值及各因素间的交互作用[10]。最后通过软件计算，分析得到各因素的最优处方中满山红油，IPM，EL-40的质量分别为0.45g，0.07g，0.63g。

2.6 验证试验 根据优化的最佳处方，分别精密称取满山红油、IPM、EL-40各0.45g，0.07g，0.63g，制备 3 批满山红油自乳化样品，预测粒径为29.89nm，自乳化时间11.59s。以最佳预测的处方比例进行验证试验，结果各指标的偏差绝对值均较小，证实所建模型预测性良好，方法可行，结果见表7。

表7 Box-Behnken 响应面优化法的验证

注：偏差%=(预测值-实测值)/预测值×100%。

3 讨论

满山红油作为止咳祛痰，治疗急、慢性支气管炎的临床用药，资源丰富、疗效确切，具有很高的开发价值和应用前景，但其有较强的疏水性，导致不能发挥出全部的药效，生物利用度较低。自乳化释药系统可提高药物的溶解度，促进药物的吸收速度和程度，提高生物利用度，降低毒副作用，且多数情况下其吸收比单纯制备普通片剂或胶囊剂更迅速、更有效，因此，采用自乳化释药技术处理满山红油后再进行制剂开发，可以更好的发挥临床治疗效果。

自乳化乳液的粒径是评价自乳化效果的一个至关重要的指标，粒径越小，乳液越稳定，越容易被机体吸收，生物利用度越高[11]。乳化时间能够直观的反应出自乳化制剂的乳化效率，乳化时间越短，效率越高。本实验采用 Box-Behnken 响应面法筛选的满山红挥发油SEDDS处方，制得自乳化系统乳液的粒径布均匀，性质稳定，且处方中原料药为挥发油，具有充当油相的效果，提高有效成分含量。

自乳化系统通常由三种或三种以上的物质组成，处方中各组分存在交互作用且彼此间不同的配比会影响自乳化液的粒径及乳化时间。本实验在伪三元相图的基础上，采用 Box-Behnken 响应面法对处方进行细化，可以直观、准确地筛选出最优处方，使其更具有科学性。最优处方的响应值与预测值相吻合，为该自乳化释药体系制备满山红油口服纳米乳或软胶囊等剂型方面提供有益参考。