肠康胶囊的质量标准研究

李 晰 吴 丹 赵 美 肖爱萍 孙 涛 赵敏杰 刘琳娜 张 琰

空军军医大学第二附属医院药剂科，陕西西安 710038

肠康胶囊[兰制字（2011）F68014 号]为空军军医大学附属医院（以下简称“我院”）根据验方研制并采用现代制剂技术制备的院内中药复方制剂，组方依据传统中医古方，由黄连、木香、血竭、延胡索等药味组成，具有益气固本，健脾渗湿，固肠止泻的功效，适应于结肠炎、溃疡性结肠炎及各种急慢性肠炎。为了有效控制肠康胶囊的产品质量，保证临床治疗效果，本研究建立了薄层层析法（TLC）用于定性鉴别肠康胶囊中的黄连、木香、血竭、延胡索；并建立了高效液相色谱法（HPLC）用于同时测定黄连中的主要有效成分小檗碱及巴马汀的含量。经过方法学验证，本研究确立的定性定量分析方法能够客观的反映肠康胶囊的内在品质，为本品的质量控制与评价指标提供重要的理论依据，为提高药品的安全性及有效性奠定理论基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

ZF-2C 型暗箱式自动UV 分析仪（上海安灵电子仪器厂）；安捷伦1260 型HPLC 分析仪（美国安捷伦科技公司）；BP211D 型电子天平（万分之一，德国赛多利斯集团）；KH5200DB 型数控超声波清洗仪（昆山禾创超声仪器有限公司）；硅胶G 预制薄层板（青岛海洋化工有限公司、青岛海浪硅胶有限公司、浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂）。

1.2 试药

黄连药材对照品（批号：120921～201309）、木香药材对照品（批号：120921～201309）、延胡索药材对照品（批号：120928～201208）、盐酸小檗碱对照品（批号：110713～201212，纯度：86.7%）、盐酸巴马汀对照品（批号：110732～201309，纯度：87.4%）、延胡索乙素对照品（批号：110726～201516，纯度：99.8%），上述对照品均购于中国药品生物制品检定所；肠康胶囊[由我院提供，兰制字（2011）F68014 号，规格：每粒0.45 g，批号：20130904、20121204、20131104]；所用药材均购于西安藻露堂西京医药有限公司；乙腈（赛默飞世尔科技公司）和冰乙酸（迪马科技有限公司）为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 黄连的薄层鉴别 取本品2 粒，内容物倾出置于干燥的锥形瓶中，加甲醇10 mL，振摇提取5 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取黄连药材对照品0.1 g，按上述方法制成黄连对照药材溶液。另用天平称取盐酸小檗碱对照品，定量甲醇溶解制成质量浓度为0.5 mg/mL 的溶液，作为盐酸小檗碱对照品溶液。不含黄连的阴性样品根据处方比例及制备工艺制成，并以供试品溶液制备方法制成相应阴性对照溶液。分别吸取上述4 种溶液各1 μL，依次点于薄层板上，以异丙醇-乙酸乙酯-甲苯-甲醇-水（1.5∶3.0∶6.0∶1.5∶0.3）为展开剂，以40%的浓氨水溶液将展开系统饱和15 min后展开薄层板，展距8 cm，取出晾干，于紫外光灯（365 nm）下检视。在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应的位置处，供试品溶液色谱所显同一颜色荧光斑点，阴性对照溶液在对应位置处，无其他成分斑点干扰（图1）。

图1 黄连薄层色谱图

2.1.2 木香的薄层鉴别 取本品10 粒，将内容物倾出置于干燥锥形瓶中，加甲醇30 mL，超声提取30 min，滤过，滤液于60℃水浴锅中挥干溶剂，残渣加甲醇1 mL复溶，作为供试品溶液。另取木香药材对照品0.5 g，按上述方法制成木香对照药材溶液。不含木香的阴性样品根据处方比例及制备工艺制成，并以试品溶液制备方法制成相应阴性对照溶液。分别吸取上述3 种溶液各1 μL，依次点于薄层板上，以甲酸乙酯-环己烷-甲酸（1.0∶3.0∶0.2）混合溶液为展开剂，将薄层板放置于展开系统中，饱和20 min 后展开，展距8 cm，取出晾干，香草醛硫酸溶液为显色剂喷于薄层板表面，吹风机加热使斑点显色清晰。在与木香对照药材溶液色谱相应的位置处，供试品溶液色谱所显同一颜色荧光斑点，阴性对照溶液在对应位置处无其他成分斑点干扰（图2）。

图2 木香薄层色谱图

2.1.3 血竭的薄层鉴别 取本品2 粒，内容物倾出置于干燥锥形瓶中，加乙酸乙酯10 mL 振摇提取5 min，过滤，取续滤液作为供试品溶液。另取血竭0.1 g，按上述方法制成血竭对照药材溶液。另取血竭素高氯酸盐对照品约9 mg，置于50 mL 棕色量瓶中，加入含3%H3PO4的甲醇溶液使溶解，并定容至刻度，充分摇匀，精密量取1 mL，置5mL 棕色容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，作为血竭素高氯酸盐对照品溶液。不含血竭的阴性样品根据肠康胶囊的处方比例及制备工艺制成，并以试品溶液制备方法制成相应阴性对照溶液。分别吸取上述供试品溶液、阴性对照溶液5 μL，以及血竭素高氯酸盐对照品溶液、血竭对照药材溶液各3 μL，依次点于薄层板上，以甲醇-二氯甲烷（1∶19）混合溶液为展开剂，将薄层板置于展开系统中，饱和20 min 后展开，展距8 cm，取出晾干，日光下检视。在与血竭素高氯酸盐对照品溶液和血竭对照药材溶液色谱相应的位置处，供试品溶液色谱所显同一颜色荧光斑点，阴性对照溶液在对应位置处无其他成分斑点干扰（图3）。

图3 血竭薄层色谱图

2.1.4 延胡索的薄层鉴别 取本品内容物20 g，置于干燥的锥形瓶中，加甲醇100 mL，超声处理30 min，滤过，80℃水浴蒸干溶剂，残渣加30 mL 水复溶，并滴加氨试液将溶液调至碱性，乙酸乙酯每次30 mL 萃取3 次，合并乙酸乙酯层溶液，并于80℃水浴挥干乙酸乙酯溶剂，所得残渣加1 mL 甲醇复溶，作为供试品溶液。另取延胡索药材对照品1 g，按上述方法制成延胡索对照药材溶液。另称取延胡索乙素对照品，定量甲醇制成0.5 mg/mL 的延胡索乙素对照品溶液。不含延胡索的阴性样品根据处方比例及制备工艺制成，并以试品溶液制备方法制成相应阴性对照溶液。分别吸取上述供试品溶液、不含延胡索的阴性对照溶液各3 μL，延胡索乙素对照品溶液、延胡索对照药材溶液各1 μL，依次点于薄层板上，以丙酮-甲苯（1.0∶4.5）混合溶液为展开剂，将薄层板置于展开系统中饱和20 min 后展开，展距8 cm，取出晾干，置碘缸中约3 min 后取出，室温下挥尽薄层板上吸附的碘后，置紫外光灯（365 nm）下检视。在与延胡索对照药材和延胡索乙素对照品色谱相应的位置处，供试品溶液色谱所显同一颜色荧光斑点，阴性对照溶液在对应位置处无其他成分斑点干扰（图4）。

图4 延胡索薄层色谱图

2.1.5 薄层鉴别方法学验证 薄层鉴别方法均根据《中华人民共和国药典2015 年版》[1]四部通则TLC 法试验标准操作，并进行了溶液稳定性、样品提取时间、样品萃取次数以及不同品牌薄层板、温度、相对湿度对薄层展开的影响。

方法学验证结果表明，供试品溶液在24 h 之内稳定性良好；不同品牌薄层板测定斑点清晰，且背景无干扰；湿度32%～88%条件下均可得到清晰斑点，且背景无干扰；木香主斑点在4℃、25℃条件下的比移值有增大，斑点清晰，背景无干扰，不影响鉴别结果，但在32℃条件下的比移值明显增大，且斑点易偏斜，其他供试品主斑点在4～32℃条件下的比移值随温度升高而稍有增大，但斑点清晰，背景无干扰，不影响鉴别结果；并根据薄层色谱斑点确定了黄连、木香、血竭、延胡索提取时间及延胡索提取液经乙酸乙酯萃取次数。

2.2 含量测定

2.2.1 对照品储备液的制备 精密称取适量的盐酸小檗碱对照品，甲醇溶解，充分摇匀后定容，制得质量浓度为98.0 μg/mL 的盐酸小檗碱对照品贮备液。精密称取适量的盐酸巴马汀对照品，加甲醇溶解，充分摇匀后定容，制得质量浓度为31.8 μg/mL 的盐酸巴马汀对照品贮备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品内容物约0.5 g，精密称定，加入盐酸-甲醇（1∶100）混合溶液50 mL，称定重量，超声处理30 min，取出，置于室温下放凉，再次称定重量，以甲醇补足超声过程中损失的重量，充分摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 缺黄连阴性对照溶液的制备 不含黄连的阴性样品根据处方比例及制备工艺制成，并根据“2.2.2”项制成缺黄连阴性对照溶液。

2.2.4 色谱条件与系统适应性试验 Angilent XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱；流动相：乙腈-0.05 mol/L KH2PO4溶液（50∶50，v/v）（每100 mL 溶液中加入十二烷基硫酸钠0.4 g，再以H3PO4调pH 值至4.0）；流速：1.0 mL/min；检测波长：345 nm；柱温：室温；进样量：10 μL。理论板数按小檗碱色谱峰及按巴马汀色谱峰计算不低于2000。目标峰与相邻色谱峰分离度良好，阴性对照溶液无杂质干扰（图5）。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取储备液溶液适量，用甲醇稀释成含盐酸小檗碱（29.4、58.8、68.6、78.4、98.0 μg/mL）系列对照品溶液及含盐酸巴马汀（7.1、14.2、17.8、25.4、31.8 μg/mL）系列对照品溶液，测定小檗碱及巴马汀色谱峰面积，并分别以浓度为横坐标（X），色谱峰面积为纵坐标（Y），计算线性回归方程。小檗碱在线性范围29.4～98.0 μg/mL、巴马汀在线性范围7.1～31.8 μg/mL 内具有良好的线性关系。见表1。

图5 HPLC 色谱图

表1 小檗碱、巴马汀线性关系

2.2.6 精密度试验 精密吸取同一浓度的供试品溶液，重复进样6 次，HPLC 测定小檗碱色谱峰及巴马汀色谱峰面积，结果显示小檗碱峰面积的RSD 为0.22%（n=6），巴马汀峰面积的RSD 为0.21%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验 取同生产批号内容物6 份各0.5 g，依照“2.2.2”项方法制备并进行HPLC 测定小檗碱、巴马汀的峰面积。测得重复性试验样品中小檗碱的峰面积RSD 为1.65%（n=6），巴马汀的峰面积RSD为1.28%（n=6），表明该分析方法具有良好的重复性。

2.2.8 稳定性试验 取“2.2.7”项下供试品溶液，分别在供试品溶液制备后4 个时间点：0、6、12、24 h 进行HPLC 测定小檗碱、巴马汀的峰面积，结果显示不同时间点时小檗碱的色谱峰面积RSD 值为0.75%，巴马汀的色谱峰面积RSD 值为0.76%，表明供试品溶液在制备后的24 h 内基本稳定。

2.2.9 加样回收率试验 取同生产批号已知含量的肠康胶囊内容物9 份各0.5 g，精密称定，分3 组，每组3 份，分别加入高、中、低3 种浓度的盐酸小檗碱及盐酸巴马汀对照品溶液，依照“2.2.2”项方法制备，测定小檗碱、巴马汀的峰面积，计算肠康胶囊中小檗碱、巴马汀的平均加样回收率及RSD 值，结果显示该测定方法加样回收率良好。见表2～3。

表2 小檗碱加样回收率

表3 巴马汀加样回收率

2.2.10 样品含量测定 取不同生产批号肠康胶囊样品（20130904、20121204、20131104），按“2.2.2”项下制备并进行含量测定。见表4。

表4 肠康胶囊样品的含量测定结果（mg/粒）

3 讨论

3.1 黄连的含量测定

黄连为肠康胶囊制剂中的君药，其主要药效成分为小檗碱、巴马汀等生物碱。《中华人民共和国药典2015 年版》[2]中黄连药材的含量测定采用HPLC，以盐酸小檗碱计小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱四种生物碱的含量。巴马汀为季铵型生物碱，近年来药理学研究表明具有较好的清热解毒功效，临床上主要用于治疗妇科炎症、肠道炎症、呼吸道以及泌尿道感染等疾病[3-5]。故本研究在原质量标准中对小檗碱进行含量测定的基础上，增加另一药效成分巴马汀的含量测定[6-8]，更好地控制制剂的内在品质，保证药物的临床治疗效果。

3.2 黄连、木香的鉴别方法优化

黄连中有效成分主要为生物碱，在甲醇中溶解度较高[9-10]，经提取方法、提取时间考察发现，振摇5 min即可将黄连中有效成分提取以供鉴别，可极大程度缩短检验操作时间，更便于实验操作。

木香主要有效成分为挥发油类物质，在有效成分提取时常采用醇提法[11-12]，且挥发油类物质热稳定性较差[13-14]，因此将提取方法改为甲醇超声提取后60℃水浴锅挥干复溶，经方法学验证表明，该提取方法可有效提取木香中的主要成分。

3.3 血竭、延胡索的鉴别方法考察

血竭素为血竭中的主要有效成分，具有较强的镇痛、止血作用[15-16]，胡索中的延胡索乙素具有抗溃疡的药理作用，临床常配伍其他中药治疗多种消化系统疾病[17-19]。故本研究在原有质量标准的基础上增加了血竭、延胡索两味药材的TLC 鉴别方法。

血竭、延胡索的TLC 鉴别方法均参照《中华人民共和国药典2015 年版》[1]血竭药材、延胡索药材的TLC鉴别方法，但原方法中使用易制毒试剂“乙醚”“氯仿”作为提取溶剂和展开溶剂，影响检验操作的安全性，因此对原TLC 鉴别方法进行溶剂的优化改进，采用“乙酸乙酯”代替“乙醚”，“二氯甲烷”代替“氯仿”[20-21]，有效提高了检验操作的安全性，并为寻找易制毒试剂的替代溶剂提供了实验依据。