复发性流产患者血栓前状态分析及其与MTHFR 基因C677T 位点多态性的相关性研究

宋金龙 陈萍萍 王鹏鲲 赖毛华 马红霞 李 娟

1.广州医科大学附属第一医院检验科，广东广州 510120；2.广州医科大学附属第一医院中医科，广东广州 510120

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA），一般是指与同一配偶连续发生3 次或以上的自然流产，在妊娠女性中发生率为1%～5%[1-2]。也有国外和部分中国学者将连续2 次及以上妊娠物或胎儿丢失定义为RSA[3]。RSA 病因主要包括染色体异常、女性生殖道解剖结构异常、凝血功能异常、内分泌失调、免疫因素、感染因素以及男性因素等，临床上仍有30%～40%的患者流产原因未明确[4]。有研究显示[5]，50%～65% RSA 妇女中至少存有一种遗传性或获得性血液高凝状态，而这种血液高凝状态又称为血栓前状态（pre-thrombotic state，PTS）。RSA 与母体内凝血功能异常的相关性仍没有受到足够的重视，且RSA 患者没有明显的临床表现，其诊断较为困难，血栓前状态的诊断标准正处于探索阶段。此外，国内外对于亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR） 基因C677T 位点突变与RSA 相关性结论仍存在争议。因此，本研究主要从PTS 及MTHFR 基因C677T 位点突变两方面进行研究，探讨其与RSA 的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018 年9 月—2019 年3 月于广州医科大学附属第一医院（以下简称“我院”）就诊的77 例RSA患者作为RSA 组，年龄21～40 岁。纳入标准：经诊断确诊为RSA，28 周以前发生流产史连续3 次或以上。排除标准：①经过系统流产的病因筛查，排除自然流产明确病因，包括夫妇染色体异常、解剖异常、内分泌异常、感染以及抗磷脂综合征；②排除静脉栓塞病史；③排除急、慢性肝脏及肾脏疾病，全身恶性肿瘤，自身免疫性疾病。选择同期在我院进行孕前检查的健康女性41 名作为正常对照组，年龄23～40 岁。纳入标准：具有正常生育史的健康妇女。排除标准：有任何原因导致的流产史。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 观察指标及样本采集 统计两组凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）、活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、抗凝血酶-Ⅲ（antithrombin-Ⅲ，AT-Ⅲ）、蛋白C（protein C，PC）、蛋白S（protein S，PS）缺陷发生率等指标，并比较两组MTHFR 基因C677T 位点的基因多态性。AT-Ⅲ活性参考值：80～120，＜80 为AT-Ⅲ缺陷；PC 活性参考值：70～130，＜70 为PC 缺陷；PS 活性参考值：55～140，＜55 为PS 缺陷。采用静脉穿刺抽取法抽取5 mL，全血样本2 mL，凝血管3 mL。凝血管抽取后30 min 内，经3000 r/min 离心15 min，上仪器检测凝血4 项；剩余血浆标本放入-80℃冰箱储存，3 个月内进行易栓症3 项检测；全血标本1 个星期内进行血液基因组提取。

1.2.2 主要试剂与仪器 血液基因组提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，货号：DP349]；Premix ExTaq酶体系（大连宝生物工程有限公司，货号：RR320A）；标准分子量Marker DL2000（天根生物科技有限公司，货号：MD114）；PS 活性测定试剂盒（法国思达高公司，货号：00746）；PC 活性测定试剂盒（法国思达高公司，货号：00671）；AT-Ⅲ活性检测试剂盒（法国思达高公司，货号：00672）。全自动立式凝血分析仪（法国思达高公司，STA-R Max）；聚合酶链反应（PCR）仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司，ABI9700 型）；微量紫外分光光度仪（赛默飞世尔科技公司，NanoDrop2000）；电泳仪和BioRAD 凝胶成像系统（美国伯乐生命医学产品有限公司，SYSTEM GelDoc XR+）。

1.2.3 血液基因组DNA 的提取以及浓度测定 依照血液基因组提取试剂盒的说明书进行DNA 提取，采用Nano Drop 2000 微量紫外分光光度仪对DNA 质量及浓度进行检测，用提取盒中洗脱液进行调零，吸取提取好的核酸2 μL 进行浓度和纯度测定。

1.2.4 MTHFR 基因片段扩增以及琼脂糖凝胶电泳 引物参考文献[6]，由生工生物工程股份有限公司合成，PCR 反应体系为20 μL：Premix ExTaq Mix 为10 μL，引物各为1 μL（10 pmol/μL），DNA 模板为2 μL，补充去离子水至20 μL；PCR 反应条件：95℃预变性5 min；95℃45 s，60℃30 s，72℃45 s，共进行32 个循环；72℃延伸5 min；配置3%琼脂糖，PCR 产物5 μL 与1 μL 6×Loading buffer 混匀后点样，设置电泳参数，电压110 V，电流300 mA，时间30 min；生工生物工程股份有限公司将对含有目的条带的PCR 产物进行测序。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件对所得数据进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用两独立样本t 检验；非正态分布的计量资料以中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，采用秩和检验；计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验。以ROC 曲线方法判断易栓症在RSA 发生时AT-Ⅲ、PC、PS 活性的最佳临界值。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组人群一般资料比较

两组人群年龄、体重、血压和血红蛋白比较，差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。见表1。

2.2 两组人群PT、FIB、APTT、TT 水平比较

两组人群PT、APTT、TT 水平比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。RSA 组FIB 水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

2.3 两组人群AT-Ⅲ、PC 和PS 缺陷发生率比较

两组人群AT-Ⅲ、PC 缺陷率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。RSA 组PS 缺陷发生率高于正常对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

表1 两组一般资料比较[M（P25，P75）]

表2 两组人群PT、FIB、APTT、TT 水平比较

表3 两组人群AT-Ⅲ、PC 和PS 缺陷发生率比较[例（%）]

2.4 易栓症三项AT-III、PC、PS 诊断RSA 的ROC 曲线

仅PS 指标具有筛查意义（P ＜0.01），以PS 判断RSA 患者存在PTS 的最佳临界值为45%，曲线下面积为0.701（95%CI：0.611～0.791，P<0.01），灵敏度为95.1%，特异度为42.9%。见图1。

图1 易栓症三项AT-Ⅲ、PC、PS 诊断RSA 的ROC 曲线

2.5 MTHFR 基因PCR 扩增电泳

RSA 组与正常对照组MTHFR 基因经PCR 反应后都能扩增出目的基因条带，长度为198 bp，以其中15 个标本电泳结果为例。见图2。

2.6 MTHFR 基因C677T 位点基因型和等位基因频率分布比较

经Hardy-Wenberg 遗传平衡定律检验，所有基因型在两组中均符合遗传平衡，具有群体代表性。两组人群中基因型比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。两组人群等位基因频率比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表4。

图2 MTHFR 基因PCR 扩增电泳

表4 MTHFR 基因C677T 位点基因型和等位基因频率分布比较[例（%）]

3 讨论

RSA 的原因非常复杂，在孕妇妊娠的过程中，胚胎生长发育环境的平衡一旦遭到破坏，就可能会导致流产等不良的妊娠结局[3]。已有的临床研究发现许多有不良妊娠结局的妇女都存在血栓形成的倾向，包括胎儿生长受限、妊娠高血压、稽留流产、胎盘早剥以及不明原因的RSA 等。这种因血液持续高凝状态以致血栓形成的风险增加称为易栓症，也称为PTS[7]。

作为PTS 的一种独立危险形成因素，高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，Hhcy）可损伤血管内皮细胞，形成胎盘部位或者子宫螺旋动脉血栓，从而导致胎儿的供血不足，甚至可导致流产[8]。Hhcy 为血管粥样硬化和动静脉血栓疾病常见的强烈的高危因素[9]，遗传性Hhcy 主要由MTHFR 基因突变导致。在DNA 甲基化过程中，MTHFR 作为调节半胱氨酸和四氢叶酸代谢的关键酶也起到了关键的作用，该基因位于染色体1p36.3 的位置，全长19.3 kb，mRNA 全长7105 bp，共有12 个外显子，为常染色体显性遗传[10]，该基因的突变可能会引起不良妊娠结局[11-12]。

FIB 是血栓形成的重要参与成分[13-14]，为一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，其作为血浆黏滞度的主要决定因素，在血小板的聚集过程中起重要作用。RSA 患者血小板和凝血功能较正常妊娠明显增强[15]，本研究中RSA 组FIB 高于正常对照组，提示RSA 组相对于正常对照组而言，更容易形成高凝易栓状态。

PTS 是指抗凝蛋白、凝血因子、纤溶蛋白等的遗传性或获得性缺陷[16]，包括PC 缺乏症、PS 缺乏症、抗凝血酶缺乏症等[17]。主要标志物包括AT-Ⅲ、PC 和PS，其中PS 是PC 的辅助因子[18]，PS 是维生素K 依赖性单链糖蛋白，主要在肝脏中合成[19]。随着凝血因子增加、抗凝血成分减少以及纤溶活性降低，在妊娠晚期孕妇会出现生理性的易栓状态，虽然这将有利于孕妇在生产后高效率、快速止血，但同时产妇患PTS 的可能性也大大增加[20-21]。本研究中RSA 组PS 缺陷率高于正常对照组，且仅PS 活性指标有筛查意义，提示PS 活性可以作为PTS 引起RSA 发生的筛查指标。两组PC 的缺陷发生率无明显区别，提示PC 缺陷者在RSA 患者中并不多见，可能是本研究样本量有限，但也有可能提示PC 缺陷与RSA 相关性并不高，这需要继续加大样本量进一步探讨和验证。

MTHFR 参与了叶酸的转运和代谢[22-23]，而某些基因位点（677 位点C→T）可引起MTHFR 酶活性的降低，引起叶酸代谢异常，使叶酸水平降低及Hhcy 的形成，从而增加了血液高凝易栓的风险，造成不良妊娠结局。677 位点C 突变为T 的孕妇会增加RSA 的风险[24-25]，还可能与C 基因位点可能对Hhcy 水平有抑制作用，而T 基因位点有促进Hhcy 水平增高的作用有关。本研究结果显示RSA 组CT、TT 基因型分布频率均高于正常对照组，且RSA 组T 等位基因分布频率高于正常对照组，证实了MTHFR C677T 基因突变与RSA 的发病具有一定相关性。

综上，本研究初步证实了PTS 与RSA 的发生存在明显的相关性，是引起流产的重要因素之一。同时证明了RSA 与MTHFR 基因C677T 位点多态性有一定的相关性，但是本研究存在样品量不足以及未检测叶酸和Hhcy 水平等问题。在临床实践中应重视RSA 患者的PTS 评估，有利于在孕前发现遗传性RSA患者，从而开始早期抗凝治疗，改善妊娠结局以及并发症。