Skp2 高表达与骨肉瘤患者新辅助化疗耐药之间的联系

2020-01-01许多辉宋正南白靖平

中国医药导报 2020年31期

许多辉丁路余伟宋正南白靖平

1.新疆医科大学第三临床医学院骨软科，新疆乌鲁木齐 830000；2.新疆医科大学第五临床医学院骨一科，新疆乌鲁木齐 830000

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是好发于儿童和青少年的骨恶性肿瘤[1-2]。新辅助化疗使骨肉瘤5 年生存率大幅度提高[3-4]，近几十年5 年生存率进入了平台期，化疗耐药是主要因素之一[5-6]。因此，探索骨肉瘤化疗耐药的分子机制，是改善预后的关键。

S 期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2，Skp2）可识别和降解细胞周期素依赖性激酶抑制剂（CKI），如p21、p27 等[7]。前期体外实验发现[8-10]，Skp2 可抑制细胞凋亡，增加侵袭能力，促进上皮间充质转化（EMT），敲除Skp2 可逆转上皮间质转化（EMT）特征。本研究利用公共数据库和骨肉瘤样本探讨Skp2 在患者中的表达。

1 对象与方法

1.1 数据来源和分析

GSE126209 含6 例骨肉瘤样本和5 例癌旁组织。GSE16089 含甲氨蝶呤敏感的Saos-2 骨肉瘤细胞和甲氨蝶呤耐药的Saos-2 细胞各3 株。TCGA 数据含87 例附生存信息的骨肉瘤样本。

limma 软件包计算GSE126209 和GSE16089 中的差异表达基因（DEGs）。筛选条件为logFC＞1 且P ＜0.05。clusterProfiler 软件包对DEGs 进行富集分析，筛选阈值P ＜0.05。

1.2 研究对象

收集2018 年2 月—2019 年6 月新疆医科大学第三临床医学院（以下简称“我院”）骨软科按标准方案收治的OS 患者所有患者均采用新辅助化疗方案：甲氨喋呤：8～12 g/m2、阿霉素：60～90 mg/m2、顺铂：120～150 mg/m2、异环磷酰胺15 g/m2。共2 个循环（10 d）。经我院医学伦理委员会审批及患者、家属同意后获取肿瘤及癌旁组织各17 例。见表1。按肿瘤细胞坏死率（TCNR）≥90%为非耐药，TCNR＜90%为耐药分组[11]：非耐药肿瘤组织（A 组）11 例和耐药肿瘤组织（B 组）6 例；非耐药癌旁组织（C 组）11 例和耐药癌旁组织（D组）6 例。

表1 耐药与非耐药患者一般资料比较

1.3 肿瘤细胞坏死率的测定

沿最大径做纵切面后分区。每个分区按上、中、下取材、制片后镜检。见图1。

图1 标本取材

1.4 RT-qPCR

Trizol（Ambion，15596-026）提取样本RNA，HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）（VAZYME，R101-01/02）反转录。SYBR Green Master Mix（VAZYME，Q111-02）获得RT-PCR 产物。结果以GAPDH 为内参基因进行2-△△Ct分析。

1.5 Western-blot

单去污剂裂解（含PMSF）样本，BCA 试剂盒（Solarbio）测上清蛋白浓度。WB 检测Skp2（Ab183039）、AKT（Ab18785）、p21（Ab109520）、p27（Ab32034）、FOXO1（Ab52857）、E-cadherin（Ab40772）蛋白表达。分别计算与GAPDH（Bioswamp，PAB36269）的灰度比值（%）。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料采用百分率表示，组间比较采用Fisher确切概率法。骨肉瘤预后的风险因素采用Cox 回归分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Skp2 与OS 耐药相关

Skp2 在OS 和耐药肿瘤中均上调（P ＜0.05）（图2A、2B）。富集分析示Skp2 在耐药肿瘤中参与细胞周期和FOXO 通路等（图2C）。String 数据库（https：//string-db.org）示Skp2 与AKT，FOXO 通路和细胞凋亡基因间具有互作关系（图2D）。

2.2 mRNA 表达差异

图2 Skp2 与耐药相关

RT-qPCR 结果示，与A 组比较，B 组Skp2 和AKT显著上调，p27、FOXO1、E-cadherin 显著下调，C 组Skp2、AKT、E-cadherin 显著下调，P21、P27、FOXO1 显著上调（P ＜0.05）；与B 组比较，D 组Skp2、p21、AKT 下调，p27、FOXO1、E-cadherin 显著上调。见图3。

图3 Skp2、AKT、p21、p27、FOXO1、E-cadherin 在不同分组中的mRNA 表达差异

2.3 蛋白表达差异

Western-blot 结果示，与A 组比较，B 组Skp2 和AKT 显著上调，p27、FOXO1、E-cadherin 显著下调，C组Skp2、AKT、E-cadherin 显著下调，P21、P27、FOXO1显著上调（P ＜0.05）；与B 组比较，D 组Skp2、p21、AKT 下调，p27、FOXO1、E-cadherin 显著上调。见图4。

2.4 骨肉瘤预后的风险因素

Cox 回归分析结果示，Skp2、AKT 和p27 的风险比均＞1，且P <0.05 可能是OS 患者预后的风险因素。见表2。

3 讨论

化疗可杀灭微小转移灶，但常伴有耐药的发生[12-13]。Skp2 与多种肿瘤耐药相关，如前列腺癌、乳腺癌、OS等[14-15,8]。本研究首先识别了Skp2 在OS 和耐药OS 中表达上调，且Skp2 高表达是预后较差的预测因素，表达下调对侵袭、肺转移具有抑制作用[16]。

Skp2 泛素化促进AKT 活化，与预后不良有关[17]。在食管鳞癌中，抑制AKT 磷酸化，可抑制Skp2 的表达，减缓细胞增殖[18]。AKT-Skp2 通路可能是改善OS化疗效果的靶通路。另外，Skp2 抑制OS 细胞中E-cadherin、FOXO1、p21 和p27 表达，抑制细胞凋亡[10,19]。然而，分子检测示p21 在耐药肿瘤组与非耐药组间无明显差异，提示p21 的生成和降解不仅受Skp2 的调节[20]。Skp2 通过对p27 的降解，在OS 的发生和发展中发挥重要作用，是OS 的重要预后指标[21-22]。研究表明Skp2 通过降解E-cadherin 促进细胞迁移[23]。E-cadherin 与EMT 诱导的转录抑制因子相互作用，并与肿瘤细胞化疗耐药间存在着紧密联系[24-25]。同时，Cox 分析结果显示，性别、Skp2、AKT、p21 和p27 可能是OS 患者生存时间的风险因素，需要进一步研究和探讨。