白芷指纹图谱研究进展*

孙艳雪，关海滨，乔 颖，张红梅，黄若晖，周志华，张 烨

内蒙古医科大学药学院(呼和浩特 010110)

白芷伞形科植物Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根。主产地分布于中国西南，东北，华北等地域[1]。白芷具有镇痛，抗炎，美白等功效[2-4]；此外小剂量的白芷对呼吸中枢，迷走神经等也有一定的兴奋作用[5]。白芷的化学成分含有香豆素类，挥发油和微量元素等[6]。《中华人民共和国药典》2015年版一部通过对是否含有欧前胡素和异欧前胡素两种成分的荧光斑点及欧前胡素的含量来控制白芷的质量。中药白芷的化学成分复杂，仅通过这两种成分的含量来控制其质量，难以得到真正的控制。查阅大量文献发现这两种成分也会同时存在于川明参等药材中，其专属性也存在缺陷，易造成假冒伪劣问题。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。指纹图谱[7]可综合反映样品化学成分种类，并根据对比其特征峰和共有峰面积进行综合评价其质量情况。指纹图谱具有特征性，系统性和整体性等特点。可更为全面地，综合地对药材进行质量控制及评价。现已被国际社会所认可。本文通过对白芷指纹图谱的研究进行总结，为白芷药材的质量评价提供参考。

1 化学指纹图谱

1.1 色谱指纹图谱

1.1.1高效液相图谱:高效液相色谱(HPLC)具有高速，高效，高灵敏度，操作自动化，应用范围广和柱子反复使用的特点。由于这些优点现已成为指纹图谱使用较多的方法之一，且已积累了较多经验。根据其成分特点进行色谱条件的选择，再结合不同的检测器，运用相似度评价系统等进行成分的数据分析。可实现白芷药材产地，优劣，真伪的区分。前人采用不同的色谱条件建立了HPLC指纹图谱。色谱柱大都采用反相C18色谱柱，而且检测波长多采用254 nm或320 nm，区别在于其他色谱条件的不同，导致其色谱峰存在一定差异。

不同产地的药材因生长环境不同，其质量可能存在一定的差异。章军等[8]使用RP-HPLC指纹图谱法区分不同品种的白芷药材。以0.1%冰醋酸乙腈和0.1%冰醋酸水为流动相，梯度洗脱，得到样品的色谱图同时进行相似度的计算。结果发现确定了11个共有指纹峰且相似度都大于0.9。将其色谱峰进行对照区分为白芷和杭白芷。吴耀华等[9]对来自不同产地的21批白芷样品有效成分含量进行测定，将其分为两组，建立HPLC指纹图谱，结果发现这21批样品中共有21个共有特征峰。两组样品的相对保留时间和相对峰面积的RSD对比后无明显差异，体现了指纹图谱的一致性及稳定性，为进一步鉴定白芷药材质量提供了科学依据。王婷婷等[10]采用相同的流动相，不同的梯度条件，对21批次的不同产地的白芷进行指纹图谱聚类分析。检测到21个共有峰，经相似度系统分析后，相似度都小于0.9，证明药材样品质量一般。张慧等[11]以甲醇和水为流动相，建立不同产地的12批白芷药材水提液的指纹图谱，结果共发现13个共有峰且色谱峰分离状况良好。可用于白芷药材的质量评价。

影响白芷质量的因素有许多，全面地分析影响白芷质量的因素，对提高其质量尤为重要。谭秋生等[12]建立了HPLC指纹图谱，分别从熏硫，采收日期，生长土壤，海拔高度，产地，表皮类型，加工方法这些方面，探究影响渝产白芷质量的主要因素。结果表明产地，土壤及采收加工方法对其质量影响最大。其相似度，除熏硫样品外，都在0.9以上。结果发现白芷经熏硫加工处理后，其香豆素含量明显减少，质量变差，这种加工方法需改进。

白芷的加工方式多种多样，不同加工方式对其质量产生不同影响。席梅等[13]以甲醇和水为流动相，梯度洗脱80 min,对来自于不同产地的10批的祁白芷，禹白芷，杭白芷，滇白芷样品进行指纹图谱分析，分别选取每个组别中的特征峰与其相对峰面积进行对比，然后进行相似度的系统检测。结果显示杭白芷，滇白芷部分批次为伪品，禹白芷为优品，其余样品质量一般。可能是生产环境和产地的不同所导致的结果。吴晓毅等[14]建立HPLC指纹法对市场上购买的来自12个药房的白芷饮片与自然晾干和硫磺熏蒸药材的指纹图谱进行对比，而后进行质量一致性的评价。对12份白芷饮片样品进行统计分析，确定有12个共有峰，并且发现硫磺熏蒸药材与饮片指纹图谱差异不大，得出这10批饮片均为硫磺熏蒸药材。9批样品的相似度都大于0.9,说明不同地域白芷饮片的质量特征性相同。卢晓琳等[15]研究不同加工方法的11批白芷样品提取物HPLC指纹图谱，其中10批未熏硫药材，1批熏硫白芷药材，色谱条件以水和甲醇-四氢呋喃为流动相，梯度洗脱60 min,结果发现10批未熏硫白芷样品的提取物图谱相似度均在0.9以上，并确定了9个特征峰且对其中8个特征峰进行了指认。对熏硫白芷样品的提取物与对照图谱进行比较后，发现部分出现缺失现象，可能是药品的处理方式对其质量产生了一定的影响。谭秋生等[16]选取不同产地的白芷样品研究加工方式对其质量的影响，建立HPLC指纹图谱。其除沙方式有水洗和刷除，而后对其进行切片或切块。结果显示各组别的相似度都在0.9以上，其中水洗+切块组的相似度最大。但水洗又造成欧前胡素含量损失，因此白芷不宜水洗和切片。白芷采后晒干工艺是传统的商品处理方法。近几十年来，一些中药肉质根或根茎的自然干燥过程已被硫磺熏蒸所取代，以缩短干燥时间和防治害虫。卢晓琳等[17]对熏硫加工前后白芷图谱进行了研究，发现白芷经硫熏后的色谱峰面积较未熏硫的普遍减小，可以作为是否熏硫的依据。而且白芷熏硫后易造成香豆素类成分含量降低，导致质量变差。认为硫磺熏蒸法是一种不可接受的中药加工方法。因此人们一直希望可以找到可以代替硫熏保存药材的方法。

1.1.2 超高效液相色谱和高分离度快速液相色谱:超高效液相色谱(UPLC)和高分离度快速液相色谱(RRLC)相关的白芷指纹图谱也有相关的报道。这两种色谱较HPLC技术而言有更高的柱效，不仅提高了分析效率和灵敏度，同时也可对其化学成分进行分析鉴定，使中药的研究有了更有效简便的方法。目前对于中药白芷的研究主要集中于香豆素类和挥发油，对黄酮类知之甚少。张静等[18]结合化学计量学和RRLC建立了27批白芷药材的指纹图谱，探究药材在硫熏前后的质量，最终确定了23个共有峰。根据相似度评价系统发现，熏硫前样本相似度都大于0.9，而进行熏硫后其相似度则为0.7～0.9。系统聚类分析和主成分分析可鉴别出白芷是否为熏硫样品；相似度评价可区分白芷产地和质量的优劣。

1.1.3 中成药指纹图谱:此外，含有白芷成分的一些中成药的指纹图谱也有相关的研究。江洁怡等[19]对一家药厂十批次白芷配方颗粒进行HPLC指纹图谱探究，确立了19个共有峰为特征峰，并进行了指认。结果发现8批样品相似度均大于0.9，而另外两批只有0.6，这两批样品色谱峰的丰度与其他样品也存在差异。可能是贮存时间过长导致成分分解所致。

1.1.4 色谱联用技术:液相色谱联用技术在白芷指纹图谱领域也有较多涉及。张超云等[20]采用HPLC和GC联用技术对11批次的白芷样品进行质量评价，结果发现HPLC图谱中各批次药材图谱差异小且相似度较高，但GC图谱中表明各批次成分含量存在一定差异，可能是挥发性成分损失导致的结果。两种色谱手段联用，系统地控制了白芷的质量，方法综合可靠。梁璐[21]建立HPLC-TLC联用法对10批白芷饮片的真伪，优劣进行探究。结果发现TLC有特征斑点且显色清晰,HPLC确定了10个共有峰，其相似度均在0.8以上,质量一般，但具有较好的相关性。两者的联用不仅可更加直观辨认其化学组成，对其质量控制也有了良好的补充。此外，采用HPLC-DAD-ESI-MSn技术共鉴定或初步鉴定了20种呋喃香豆素，以及发现电喷雾离子阱质谱仪中的破碎规律。

1.1.5 气相色谱指纹图谱:气相色谱法是一种高效能，高选择性，高灵敏度，操作简单，应用广泛的分离分析方法。应用于白芷的化学组成更加直观易辨，是对HPLC的良好补充。王婷婷等[22]对白芷挥发油气相色谱指纹图谱进行了分析，并对色素条件进行考察。最终选定SE-30毛细血管色谱柱，程序升温模式，对21批白芷药材进行聚类分析，分为四类，其中Ⅰ类，Ⅱ类为优质药材。

1.2 红外光谱指纹图谱 红外光谱有测定快，特征性强，无损检测，应用范围广等特点。而且其分辨率高，由于中药化学成分复杂，各成分含量不同，这一特点可进行多个组分定性定量分析，可用于药材的质量评价。韩嘉欣等[23]采用傅里叶变换红外光谱法结合共有峰率和变异峰率对不同品质的来自三个产地的24批白芷亲缘关系进行探讨。结果相似度均大于0.9，但川白芷和祁白芷较高，而毫白芷相似度较低。主成分分析和系统聚类分析可区分白芷产地。不同品质的白芷共有峰度，变异峰度相差较大，说明不同产地白芷成分存在差异。毫白芷质量最低，且与其他存在明显差距，可能经过熏硫处理所致。吴晓毅等[24]采用传统方法-HPLC指纹图谱-近红外光谱技术，并结合OPUS/INDENT定性分析软件对白芷进行聚类分析。研究表明湖北，江西饮片较优，质量较好，同时证明传统方式与现代分析方法分析结果相同。

2 分子生物学指纹图谱

分子生物学指纹图谱是在分子水平上运用基因序列分析方法对中药进行分析研发。郭丁丁等[25]应用ISSR标记技术对白芷新鲜叶片进行遗传分析，结果显示ISSR指纹图谱对白芷样品遗传变异分析奠定了基础。陈要臻等[26]建立不同产地白芷新鲜叶片的AFLP反应体系，选择不同引物对其进行扩增，最终筛选出7种引物，并构建了AFLP指纹图谱。这种技术为白芷鉴识和不同品种间多样性提供了标准化程序。

3 谱效关系

白芷有活血化瘀方面的作用，张慧等[27]把指纹图谱与这种活性结合后进行探索，建立了白芷提取物的HPLC指纹图谱，应用多元回归和灰色关联度相结合的方法，最终得出4、9、11、12、16号峰为活血化瘀相关峰。该研究表明基于指纹效应关系模型的定量策略可运用于中药的质量监测。

4 总 结

由于传统方法的局限性，对于中药材这种化学成分复杂的天然产物来说，有必要解决成分分离与鉴识这两个问题，而采用单一分离模式也解决不了，也可能会导致大量信息的丢失。中药指纹图谱根据其整体性，综合性，关联性和层次性等特点可用于鉴别药材真伪，考察药材优劣，区分药材不同部位，检测原料与成品之间的一致性和稳定性。本文根据指纹图谱技术的分类，综述了白芷药材及其中成药的指纹图谱的研究进展，为白芷的进一步研究和开发提供参考依据。

近年来，色谱指纹图谱被广泛地应用，且其发展速度较快。查阅大量文献后，发现白芷的质量控制多采用高效液相(HPLC)指纹图谱。其他类型的指纹图谱也在应用，仅适用范围不同。例如分子生物指纹图谱多将色谱分离与分子生物学联系起来，对白芷品种进行鉴别研究，并建立其DNA指纹图谱。随着药材商品的多样化，中药白芷假冒、伪、劣的现象越来越严重。因此大量文献都旨在控制白芷的质量。高效液相(HPLC)指纹图谱因其高速，高效，高灵敏度，应用范围广等特点，已经成为白芷指纹图谱的首选方法，且已经积累的大量经验。不仅可以单独使用，也可以与二极管阵列检测器(DAD)，质谱(MS)，气相色谱(GC)等联合应用，体现出不可逾越的优越性，同时使白芷的质量得到更好的检测。

随着对白芷指纹图谱不断深入地研究，指纹图谱与药效之间形成的谱-效关系日益得到关注。中药指纹图谱仍处于发展阶段，需达到功能图谱阶段，即谱-效关系。将指纹图谱与生物活性等相关的化学成分联系起来建立相应的综合数据库。当前，白芷谱-效关系还处于初始阶段，“谱”多集中于液相色谱指纹图谱，完整的谱还不能标示完整的“效”，无法实现其一致性。因此，深入研究白芷的谱-效关系，综合运用现代技术，明确药效物质基础，全面地控制白芷质量，进一步完善其鉴别和质量控制系统尤为重要。