单核苷酸多态性与慢性HBV感染结局相关性分析

王朝辉 李 玮

青岛市第六人民医院肝病科 (山东 青岛， 266071)

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是指有乙型病毒性肝炎或HBsAg阳性史超过6个月，且HBV DNA仍然为阳性者。慢性HBV感染严重危害人体健康，全国约有1.1亿人携带HBV，每年约有99万人死于HBV感染[1,2]。不同人群接触HBV，会产生不同的疾病表现和症状，部分人群为自限性感染，另一部分则发展为慢性病毒携带者，主要与机体接触的环境、个人免疫状况、病毒数量和杀伤力、病毒基因型、感染机体的年龄和性别等因素有关[3]。单核苷酸多态性是指在基因水平上使DNA变异，改变其序列，该过程直接影响原基因的转录和翻译，从而改变蛋白质的功能结构。早期研究发现白细胞介素(IL-8)在慢性HBV感染时表达会严重损害肝脏组织，某些特定位点的核苷酸也与基因的活性有关[4]。笔者利用DNA测序技术检测102例慢性HBV感染者和101例急性自限HBV感染者IL-8基因多态性。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年2月至2017年2月在本院门诊接受治疗的HBV感染者203例，其中102例慢性HBV感染者为试验组，101例急性自限HBV感染者作为对照组。两组患者基本资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。

表1 两组患者基本资料比较

1.2 纳入及排除标准[5，6]纳入标准：①所有患者临床诊断均符合2015年更新版《慢性乙型肝炎防治指南》；②无合并HAV、HDV、HCV、HEV感染；③均为无血缘关系的汉族人群；④均未接种过乙肝疫苗；⑤均签订知情同意协议。排除标准：①患有心血管疾病、肾脏及内分泌问题引起的肝脏功能异常；②患有肝血吸虫病，合并其他肝炎病毒感染；③之前接种过乙肝疫苗。

1.3 标本采集 采集患者外周静脉血 2 管，1 管应用 EDTA 抗凝，3 000 r/min 转速下离心5 min，分离血细胞和血浆，于-20℃冰箱保存血细胞，用以提取 DNA；另1管凝血，于 3 000 r/min 转速下离心5 min分离血清，严格按照ELISA试剂盒上步骤检测标本中血清中IL-8水平。

1.4 实验方法 在血细胞中提取DNA，并鉴定DNA纯度，若A260/A280≥1.8说明提取的DNA比较纯净，若该值小于1.6则说明之前提取的DNA纯度不够，还需再行抽取，本试验提取的DNA均符合要求。加入相关引物后，对抽取的DNA进行IL-8-251A/T、IL-8-738T/A和IL-8-845T/C位点进行PCR扩增，并对酶切产物进行鉴定测序。

2 结果

2.1 两组患者IL-8基因启动子区位点基因型及等位基因频率分布 两组患者IL-8基因251A/T位点包括AA、AT、TT 3种基因型，各基因型和等位基因频率的差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。等位基因在慢性HBV感染轻度、中度、重度中分布差异无统计学意义(P>0.05)。IL-8-738T/A和 IL-8-845T/C多态性位点PCR产物经限制酶处理无任何变异，且试验组和对照组无显著差异，都只有1种TT基因型。

表2 两组患者IL-8基因启动子区251A/T位点基因型及等位基因频率分布 [n(%)]

与对照组比较，*P<0.05

2.2 两组患者血清中IL-8的表达情况 见表3。

表3 两组患者血清中IL-8水平比较

与对照组比较，*P<0.05；与本组轻、重度比较，△P<0.05

2.3 IL-8-251A/T位点不同基因型慢性HBV感染者血清IL-8水平 见表4。

表4 IL-8-251A/T位点不同基因型慢性HBV感染者血清IL-8水平

与TT、AA基因型比较，*P<0.05；与TT基因型比较，△P<0.05

3 讨论

HBV可通过母婴、血和血液制品、破损的皮肤黏膜及性接触传播。慢性HBV感染者的临床表现复杂多样，与机体对病毒的免疫应答有关，基因多态性影响基因产物，不同基因型转录及翻译不同的蛋白质影响机体对疾病的反应[7～9]。慢性HBV感染分为4个时期：第1期为免疫耐受期，感染者处于耐受状态，不能识别和清除HBV，但肝功能表现正常，HBV DNA为高水平复制期；第2期为免疫清除期，机体免疫系统增长，开始识别出病毒并进行清除；第3期为病毒抑制期，此期病毒并没有被完全清除且处于弱势；第4期为再活动期，HBV并不甘于在免疫抑制下生存，遇到机会便通过各种方式逃过机体免疫识别。

机体感染HBV后，细胞因子在宿主细胞中清除病毒，抗原刺激机体产生相应抗体，如HBsAb和HBcAb，这些抗体会杀灭HBV。病毒核衣壳进入肝细胞，打开环状DNA转录合成信使RNA[10～12]。非细胞病变和细胞因子介质能抑制病毒复制而使细胞恢复正常功能。这些病毒复制水平极高，导致血清HBeAg和HBV DNA为阳性，肝脏并发炎症，虽并不影响肝细胞损伤但会诱导其器官损害。慢性HBV特异性反应较弱，尤其是CD4T细胞反应和CTL反应弱，不足以清除所有感染HBV，病毒持续侵害肝细胞。IL-8的介质是导致炎症的趋化因子，会在感染部位释放氧化酶和溶酶体而破坏局部组织和细胞[13,14]。细胞中的中性粒再接触机体异物是会发生呼吸爆炸反应，释放大量的活性氧化基，导致中性粒向炎症部位浸润，使炎症效应更大，组织损伤更严重。目前检测限制性片段长度多样性和单链构象多态性，等位基因核苷酸特异性杂交，采用DNA测序和PCR指纹图法等检测技术测定。IL-8目前也备受关注，作为多态性细胞因子，其多态性与疾病之间的症状联系密切相关。

研究结果显示，IL-8基因启动子区251A/T位点单核苷酸多态性与慢性HBV感染者发病存在相关性，但与疾病严重程度无明显关系。A等位基因容易诱发慢性HBV感染，血清中IL-8指标状况与病情程度有关。IL-8-738T/A和IL-8-845T/C单核苷酸多态性与慢性HBV感染者是否发病没有相关性。由于本次研究的IL-8基因多态性的分析实验对象样本较少，缺少更大的独立样本数据作为有力依靠，但本研究的结果提示IL-8单核苷酸多态性与慢性HBV感染结局的有关联性。研究IL-8基因的多态性与疾病症状的关系，可从分子水平解释发病机制，为疾病的预防和治疗提供新途径。