养肝澳平对大鼠肝纤维化的防护作用及机制探讨*

陈沁磊 邵 铭△ 何 晶 胡谦锋

1.南京中医药大学附属医院江苏省中医院感染科 (江苏 南京， 210001) 2.南京中医药大学

肝纤维化指的是由于各种致病因素导致肝脏结缔组织增生异常，以致肝脏内弥漫性细胞外基质(ECM)过度沉淀的病理过程。现在普遍认为肝星状细胞的活化是肝纤维化的中心环节。若未得到及时干预则会进入到肝硬化的阶段。本文对养肝澳平合剂抗肝纤维化的效果以及作用机制进行深入研究。使用四氯化碳/橄榄油诱导大鼠肝纤维化模型，监测大鼠血清生化指标、肝组织含量及肝脏病理改变，对养肝澳平合剂治疗肝纤维化的作用进行综合评估，探讨肝纤维化与细胞转化生长因子(TGF)-β1、基质金属蛋白酶(TIMP)-1之间的表达关系。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 动物：SD大鼠84只，雌雄各半，清洁级，体质量(180±20)g。由江苏省中医院实验室提供。动物合格证号：SCXK-(苏)2012-0004，扬州大学比较医学中心。

药物：养肝澳平合剂：由茵陈、当归、丹皮、茜草、凤尾草、蛇舌草、赤芍、郁金、砂仁、紫草、大腹皮、丹参、土茯苓等组成，江苏省中医院制剂室提供，批号：Z04000376。扶正化瘀胶囊：由丹参、发酵虫草菌粉、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子组成，上海黄海制药有限责任公司，批号：Z20020074。秋水仙碱片：云南昊邦制药有限公司，批号：H53021798。

试剂：四氯化碳分析纯：南京化学试剂有限公司，批号：13052910772 。使用时用橄榄油配合成40%的油溶液。甲醛溶液：南京化学试剂有限公司，批号：12042410659；(TGF)-β1、TIMP-1抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：20100328。即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒：福州迈新生物公司提供，批号：KIT-5030总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒、羟脯氨酸(HyP)测试盒，购自南京建成生物工程研究所。考马斯亮兰蛋白定量测试盒，购自南京建成生物工程研究所。

仪器：TDL-80-2B低速离心仪：上海安亭科学仪器厂；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；MODEL DS-671电子秤：上海寺冈电子有限公司；756PC紫外线分光光度计：上海光谱仪器有限公司； RM2135型石蜡切片机：德国LEICA公司产品； Tissue-Tek TEL 组织包埋中心：日本SAKURA公司产品；DM-2000光学显微镜：德国LEICA公司产品。

1.2 造模分组及给药方法 84只清洁级SD大鼠随机分为7组，即正常组10只，模型组14只，养肝澳平高、中、低剂量组各12只，扶正化瘀及秋水仙碱组各12只。SD大鼠肝纤维化造模采用40%的四氯化碳/橄榄油腹腔注射，剂量为1 ml/kg，每周2次，共4周。造模1周后给药。正常组与模型组用蒸馏水按20 ml/kg的量进行灌胃；其中养肝澳平高、中、低剂量组给药浓度分别为28、14、7 g/kg，扶正化瘀组给药浓度剂量为0.9 g/kg，秋水仙碱组剂量为1.0 mg/kg，每天按20 ml/kg的药量灌胃给药1次，共给药8周。所有大鼠每周称重1次，根据体质量变化情况调整给药剂量。

1.3 指标检测

1.3.1 病理学指标检测 采用HE染色和Masson染色法。参照1995年慢性肝炎肝纤维化分级分期标准。

1.3.2 血清生化指标 血清分离后直接用全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转化酶(GGT)、总胆红素(TBil)、直接胆红素(DBil)含量，由江苏省中医院检验科协助完成。

1.3.3 肝组织T-SOD、MDA、HyP含量测定 先采用考马斯亮蓝法计算出待测样本蛋白浓度，再按公式计算出肝组织T-SOD、MDA含量。

1.3.4 TGF-β1、TIMP-1含量的检测 采用快速免疫组化方法。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0软件分析。计量资料用表示，组间差异用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法检验，统计前均对各组数据进行正态性检验和方差齐性检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠生存情况 整个实验过程中，共死亡12只大鼠，其中正常组1只，模型组6只，高剂量组1只，低剂量组1只，扶正化瘀组1只，秋水仙碱组2只。

2.2 各组肝脏病理变化情况 HE染色发现模型组可见肝小叶结构破坏并重新排列，小叶内及小叶间有明显的炎症、坏死，肝细胞变性坏死，肝索排列不规则，伴有明显的纤维组织增生。各治疗组肝损伤均有不同程度的减轻，养肝澳平高剂量组仅有轻度炎性浸润及脂肪变性，肝细胞水肿不明显，无明显的纤维组织增生。秋水仙碱组及扶正化瘀组亦有肝纤维组织增生减少、纤维间隔变窄及炎症减轻等，但肝纤维化程度以养肝澳平组最优。见彩插页图1。Masson染色显示模型组表现为小叶结构破坏，胶原纤维弥漫性增生，并形成条索状像周围布散，形成纤维间隔。治疗组均有不同程度的肝纤维化，但较模型组有明显减轻。养肝澳平高剂量组最优，仅有少量呈淡蓝色的胶原纤维，无明显肝小叶破坏及纤维间隔；秋水仙碱组次之，汇管区周围可见有少量纤维组织沉积，其余组肝纤维化无明显差异。见彩插页图2。各组大鼠肝纤维化分级评分见表1。

表1 各组大鼠肝纤维化分级评分 (只)

2.2 各组大鼠血清生化指标的比较 见表2。

表2 各组大鼠血清生化指标比较

与正常组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.3 各组大鼠肝组织T-SOD、MDA、HyP含量的比较 见表3。

表3 各组大鼠肝组织T-SOD、MDA、HyP含量

与正常组比较，△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.4 各组大鼠肝组织TGF-β1、TIMP-1表达 模型组TGF-β1表达明显增加，汇管区、纤维间隔可见大量加深的阳性染色。其余各组可见TGF-β1不同程度减少，养肝澳平高剂量组尤显，仅在汇管区可见少量阳性染色。TIMP-1在模型组阳性表达范围较广，尤其是纤维间隔、汇管区、窦周细胞，棕黄色着色。养肝澳平高、中剂量组及秋水仙碱组TIMP-1沉积明显减轻，阳性细胞数目显著减少。各组大鼠肝组织TGF-β、TIMP-1的平均光密度值，见表4。

表4 各组大鼠肝组织TGF-β1、TIMP-1平均光密度值比较

与正常组比较，△P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

肝纤维化是慢性肝病发展成为肝硬化的共同病理基础，其中肝星状细胞的活化是中心环节。因此对肝纤维化的治疗及机制探讨极为重要。

SOD、MDA为脂质过氧化物指标，SOD主要反映氧自由基的清除能力，有“高效的清道夫”之称[1]。MDA则能反映肝细胞膜脂质过氧化的强弱,能反映肝脏损伤的程度[2]。二者配合测定从而更准确地反映肝纤维化的程度。HyP是胶原纤维组织中特有的非必须氨基酸，间接反映肝脏胶原蛋白的含量，直接反映肝纤维化的程度。TGF-β1是目前被认为最强的肝纤维化致病因子，不仅能通过“旁分泌”的形式多途径促进肝星状细胞(HSC)的活化,加速胶原纤维的合成及ECM的沉积；还能阻止MMPs的合成、促进TIMPs生成，从而抑制ECM的降解[3]。TIMPs是抑制MMPS活性的一组糖蛋白，在肝脏组织中仅发现TIMP-l和TIMP-2，其中TIMP-1的抑制作用最强。HSC激活增殖后，TIMP-1不断升高，特异性与MMP-1相结合，从而抑制MMP-1活性，减少Ⅰ、Ⅲ型胶原等ECM的降解，加速ECM的沉积及肝纤维化进程[4]。

目前中医药治疗肝纤维化主要采取扶正化瘀法，而针对清热解毒化湿法研究较少。养肝澳平合剂是江苏省中医院内制剂，是俞荣青主任的经验方，该方由茵陈、当归、丹皮、茜草、凤尾草、蛇舌草、赤芍、郁金、砂仁、紫草、大腹皮、丹参、土茯苓等组成，具有活血凉血、清热利湿解毒的功效，本方最初是在治疗慢性乙型肝炎的研究成果的基础上提出的，但对于湿热疫毒内存、血瘀于肝的肝纤维化尤为适宜。俞荣青等[5]通过用养肝澳平合剂治疗，观察慢乙肝患者的短期、长期疗效及血清乙肝病毒标志物变化，结果表明经养肝澳平治疗，血清HBV标志物转阴率增高，感染鸭血中DHBV-DNA可被抑制，肝细胞损伤减轻，肝纤维化减少。车军勇等[6]用养肝澳平合剂治疗肝纤维化患者，与对照组相比，发现治疗组患者肝功能及肝纤维化指标明显好转。姚志刚等[7]纳入湿热血瘀证型的乙型肝炎肝纤维化患者40例，服用养肝澳平治疗，并与扶正化瘀胶囊做阳性对照，发现养肝澳平合剂能明显改善患者肝功能与肝纤维化水平，升高A/G比值，并能显著改治疗患者的症状和体征。

通过本次实验研究，我们可以推测，在肝纤维化的发生发展中，养肝澳平合剂能通过减少TGF-β1的分泌，抑制HSC的活化增殖；抑制TIMP-1的表达，增加MMP-1的活性，促进Ⅰ、Ⅲ型胶原等ECM的降解，从而改善肝纤维化的进程。