通腑清营汤对脓毒症急性肺损伤大鼠Fas及肿瘤坏死因子-α水平的影响

陈乾 任潇潇 韩丹 施荣 沈晓红 熊旭东

摘要：目的  觀察通腑清营汤对脓毒症急性肺损伤大鼠Fas和肿瘤坏死因子（TNF）-α水平的影响，探讨其治疗脓毒症急性肺损伤的作用机制。方法  清洁级健康成年雄性SD大鼠随机分为模型组、中药组和地塞米松组，每组再分4个亚组（12、24、48、72 h时间点）观察，每组6只，共72只。各给药组给予相应药液灌胃，模型组给予生理盐水灌胃，每日1次，连续3 d。末次给药2 h后采用盲肠结扎穿孔术制作脓毒症急性肺损伤模型，分别于术后12、24、48、72 h处死大鼠，观察大鼠一般情况;取大鼠肺组织称重，测定大鼠肺组织湿/干重比值（W/D），HE染色观察肺组织病理变化，TUNEL法检测肺组织细胞凋亡指数（AI），Western blot检测肺组织Fas蛋白表达量;采集肺泡灌洗液标本，ELISA检测TNF-α含量。结果  中药组、地塞米松组术后大多时间点W/D值和AI均低于模型组（P<0.05，P<0.01），中药组与地塞米松组比较差异无统计学意义（P>0.05）;中药组和地塞米松组肺泡灌洗液TNF-α含量在术后不同时间点均较模型组显著降低（P<0.01），中药组肺泡灌洗液TNF-α含量术后各时间点较地塞米松组明显增加（P<0.01）;中药组和地塞米松组肺组织Fas蛋白表达在术后48、72 h较模型组明显降低（P<0.05），地塞米松组Fas蛋白表达术后48 h低于中药组（P<0.05）。结论  通腑清营汤具有减轻脓毒症急性肺损伤大鼠炎症反应及抗凋亡的作用，其机制与下调模型大鼠肺组织Fas蛋白的表达、抑制TNF-α炎症介质的水平相关。

关键词：通腑清营汤;脓毒症;急性肺损伤;Fas蛋白;肿瘤坏死因子-α;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）12-0040-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.010  开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Effects of Tongfu Qingying Decoction on Fas and TNF-α in Rats with Acute Lung Injury Induced by Sepsis

CHEN Qian， REN Xiaoxiao， HAN Dan， SHI Rong， SHEN Xiaohong， XIONG Xudong

Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM， Shanghai 200021， China

Abstract： Objective To observe the effects of Tongfu Qingying Decoction on Fas protein and TNF-α in rats with acute lung injury induced by sepsis; To discuss the mechanism of Tongfu Qingying Decoction in treating acute lung injury by sepsis. Methods Clean healthy adult male SD rats were randomly divided into model group， TCM group and dexamethasone group， each group was divided into four subgroups （12 h， 24 h， 48 h and 72 h）， with 6 cases in each group， a total of 72 rats. Each administration group was given relevant medicine for gavage， and model group was given saline for gavage， once a day for 3 d. Acute lung injury model of sepsis was prepared by cecal ligation and perforation after 2 h of last administration. Rats were sacrificed at 12， 24， 48， 72 h after operation and the general condition of rats were observed. Rat lung tissue was taken and weighed to determine the wet/dry weight ratio （W/D） of lung tissue. HE staining was used to observe the pathological changes of lung tissue. TUNEL method was used to detect the apoptosis index （AI） of lung tissue. The amount of Fas protein expression in lung tissue was detected by Western blot. The alveolar lavage fluid samples were collected and the TNF-α content was detected by ELISA.

Results Compare with the model group， W/D values and AI of TCM group and dexamethasone group were lower at most postoperative time points （P<0.05， P<0.01）， but there was no statistical significance in W/D values and AI between TCM group and dexamethasone group （P>0.05）. The content of TNF-α in alveolar lavage fluid in TCM group and dexamethasone group was significantly lower than that in the model group at different postoperative time points （P<0.01）. The content of TNF-α in alveolar lavage fluid in TCM group was higher than that in the dexamethasone group at each postoperative time point （P<0.01）. The expression of Fas protein in lung tissues of TCM group and dexamethasone group was lower than that of the model group at 48 h and 72 h after operation （P<0.05）， and the expression of Fas protein in dexamethasone group was lower than that of TCM group at 48h after operation （P<0.05）. Conclusion Tongfu Qingying Decoction has the effects of alleviating the inflammatory reaction and anti-apoptosis in rats with acute lung injury induced by sepsis. The mechanism is related to down-regulating the expression of Fas protein in the lung tissue of rats and inhibiting the expression of TNF-α inflammatory mediators.

Keywords： Tongfu Qingying Decoction; sepsis; acute lung injury; Fas protein; TNF-α; rats

膿毒症是由于机体对炎症反应失调而引发危及生命的器官功能障碍疾病^[1]，其中肺组织是脓毒症最易累及的靶器官，其超高的炎症反应被视为主要病理生理改变^[2]。研究显示，过强炎症反应可诱导细胞凋亡，并通过Fas/Fas-L凋亡途径介导脓毒症导致急性肺损伤^[3]。因此，针对细胞凋亡途径对脓毒症进行研究是近年来新的热点。由于脓毒症急性肺损伤病机为营热腑实，故本实验通过盲肠结扎穿孔术法建立脓毒症急性肺损伤大鼠模型，运用自拟方通腑清营汤干预，观察其对模型大鼠Fas及肿瘤坏死因子（TNF）-α水平的影响，为进一步阐明通腑清营汤治疗脓毒症急性肺损伤的作用机制提供依据。

1  材料与方法

1.1  动物

清洁级雄性SD大鼠，72只，体质量（180±20）g，上海中医药大学动物实验中心提供，动物质量合格证号2008001666079，动物生产许可证号SYXK（沪）2014-0008。饲养于温度20～22 ℃、相对湿度45%～55%环境，正常光照，自由摄食饮水。

1.2  药物及制备

通腑清营汤[桃仁10 g，大黄（后下）10 g，芒硝（冲）10 g，玄参15 g，赤芍15 g，当归15 g，金银花15 g，连翘15 g，麦冬10 g]，饮片由上海中医药大学附属曙光医院中药房提供并煎制。除芒硝外用10倍体积蒸馏水浸泡30 min，之后7味中药先煎煮10 min后加入大黄，再煎煮10 min，熄火留取药液。重新加6倍体积的蒸馏水进行第2次煎煮直至沸腾，再用小火煎煮20 min，熄火留取药液。将2次药液混合，纱布过滤药渣后加入芒硝，充分搅拌直至完全溶解，采用水浴蒸发方法将药液浓缩为1 g原药材/mL药液，并分装于无菌塑料瓶中，置于4 ℃冰箱保存备用。地塞米松磷酸钠注射液，山西省芮城科龙兽药有限公司，批号20160501;戊巴比妥钠，上海威奥生物科技有限公司，批号20160120。

1.3  主要试剂与仪器

TNF-α酶联免疫检测试剂盒（英国Abcam公司，批号2017006），兔抗大鼠Fas多克隆抗体（英国Abcam公司，批号2017003），β-actin多克隆抗体（上海威奥生物科技有限公司，批号2017002），DAB显色试剂盒（武汉博士德生物试剂公司，批号2017002），原位细胞凋亡试剂盒和DAB显色试剂盒（武汉博士德生物试剂公司，MK1020，批号2017004）。全自动多功能酶标仪（美国Bio-Rad公司），空气摇床培养箱（Barloworld scientific公司，型号stuarts150），Thermo Fresco17离心机（美国Thermo公司），电子分析水平（赛多利斯公司，型号BSA2245-cw），电热恒温干燥箱（天津市赛得利斯实验分析仪器制造厂，型号202-00A），电泳仪（北京市六一仪器厂，型号DYY-50），小型Trans-Blot转印槽（美国Bio-Rad公司），Mini-PROTEAN3电泳槽（美国Bio-Rad公司），包埋机（德国徕卡，型号Leica EG1160），切片机（德国徕卡，型号Leica RM2035），自动脱水机（德国徕卡，型号Leica ASP300），叶拓101数显鼓风干燥机，显微镜（日本OLYMPUS，型号BX43）。

1.4  造模

参照文献[4]方法，采用大鼠盲腸结扎穿孔术复制脓毒症模型。造模前12 h禁食不禁饮水，造模时2%戊巴比妥钠（1 mL/kg）腹腔注射麻醉并固定，备皮消毒，于腹正中切开1.5 cm切口，找到盲肠并于其根部结扎，用18号针于结扎处远端贯穿3次后放回腹腔，缝合切口。缝合后，为补充手术中丢失的体液，生理盐水（30 mL/kg）皮下注射。术后自由摄食饮水。

1.5  分组及给药

按随机数字表将实验大鼠分为模型组、中药组和地塞米松组，每组再分4个亚组（12、24、48、72 h时间点）观察，每组6只，共72只。模型组大鼠给予生理盐水灌胃（10 mL/kg），每日1次，连续3 d;中药组大鼠给药剂量按人和动物间体表面积折算等效剂量^[5]，灌胃量为9.9 g/kg，给药体积1 mL/100 g，每日1次，连续3 d;地塞米松组大鼠腹腔注射地塞米松（5 mg/kg）^[6]，每日1次，连续3 d。

1.6  标本采集

各组分别于术后12、24、48、72 h处死大鼠，并收集肺泡灌洗液和肺组织标本。

1.7  检测指标

观察大鼠术后大体情况，包括外观形态、精神状态、活动情况、呼吸状态等;用滤纸吸取右肺上叶肺组织表面渗液和血迹，称取湿重，置于60 ℃烤箱内连续烘烤72 h后达恒重，再次称重获得干重，计算肺组织湿重/干重比值（W/D），右肺中叶组织标本用4%多聚甲醛固定，并脱水、包埋，随后肺组织HE染色，光镜观察肺组织病理形态，DAB显色后苏木素复染，观察肺组织凋亡指数（AI）。各时间点收集肺泡灌洗液，将灌洗液1200 r/min离心10 min，留取上清液，-20 ℃冻存，ELISA检测肺泡灌洗液中TNF-α含量。各时间点取肺组织，冰浴条件匀浆，4 ℃、1200 r/min离心10 min，取上清液-70 ℃冰箱保存，Western blot检测肺组织Fas蛋白表达。

1.8  统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1  一般状况

模型组大鼠术后呈蜷缩状、精神萎靡，毛发竖立，腹部膨隆，呼吸急促，活动量减少，大便不通，随着时间延长，模型组大鼠情况逐渐加重;中药组及地塞米松组大鼠外观形态、精神状态、活动量等表现术后不同时间点均较模型组改善，但组间比较无明显差异。开胸后模型组大鼠肺组织色泽黯红、有瘀点和瘀斑，随着时间的延长，模型组大鼠肺组织大体情况逐渐严重;中药组和地塞米松组大鼠肺组织大体表现术后不同时间点均较模型组改善，但组间无明显差异。

2.2  肺组织病理变化

模型组大鼠随着术后时间延长，肺泡腔逐渐缩小，并伴有大量炎性细胞浸润及出血，肺间质水肿和肺实变明显;中药组、地塞米松组较模型组大鼠肺组织损伤范围较小，部分肺泡腔内有少量炎性细胞浸润和少量出血，肺间质水肿和肺实变较轻，但2组肺组织病理变化无明显差异。见图1。

2.3  通腑清营汤对模型大鼠肺组织湿重/干重比值的影响

中药组大鼠肺组织W/D在术后不同时间点均低于模型组（P<0.05，P<0.01）;地塞米松组大鼠肺组织W/D术后除12 h时间点外均低于模型组（P<0.05，P<0.01）;2组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。

2.4  通腑清营汤对模型大鼠肺组织凋亡指数的影响

中药组和地塞米松组大鼠肺组织AI在术后不同时间点均低于模型组（P<0.01），2组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2。2.5  通腑清营汤对模型大鼠肺泡灌洗液肿瘤坏死因子-α含量的影响

随着术后时间延长，模型组、中药组及地塞米松组大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量呈上升趋势，但中药组和地塞米松组大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量在术后各时间点均显著低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）;地塞米松组大鼠肺泡灌洗液TNF-α含量在术后各时间点均低于中药组，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表3。

2.6  通腑清营汤对模型大鼠肺组织Fas蛋白表达的影响

随着术后时间的延长，模型组、中药组和地塞米松组大鼠肺组织Fas蛋白表达均呈逐渐上升趋势，但中药组和地塞米松组大鼠肺组织Fas蛋白表达术后48、72 h显著低于模型组（P<0.05，P<0.01）;地塞米松组大鼠肺组织Fas蛋白表达术后48 h显著低于中药组（P<0.05）。结果见表4、图2。

3  讨论

脓毒症临床表现属中医温病范畴。通过对脓毒症急性肺损伤患者长期临床观察发现，脓毒症急性肺损伤的演变过程与卫气营血的传变过程大致类似，炎症风暴相当于温热病中气分证、营分证^[7]。脓毒症急性肺损伤时，由于营热毒邪侵袭，肺宣发肃降失常，故而可见到脓毒症急性肺损伤患者气喘表现明显，因肺输布津气失常，全身气血津液来源匮乏，同时营热更加耗竭阴液，更易导致肠中津液损耗，从而导致肠内腑气不通，燥屎内结，致使营热无外出之路，加重患者病情。因此，脓毒症急性肺损伤主要病机为营热腑实。本实验以清营热活血通腑为治疗大法，自拟通腑清营汤干预脓毒症急性肺损伤大鼠，通过清热通腑兼滋阴活血，以期祛除营分热邪。通腑清营汤具有通腑泻热、养阴活血功效。方中大黄、芒硝、桃仁为君药，三者合用共奏清热、通腑、活血化瘀之功;玄参、赤芍、当归、麦冬四者为臣药，具有養阴活血润肠之功;佐用金银花、连翘，清热解毒、疏散风热，清轻透邪，使营分热邪有外达之机，促其透出气分而解。全方泻热不忘通腑，清营不忘养营阴。

脓毒症急性肺损伤发病机制复杂，近年来，免疫炎症反应一直是脓毒症研究中的热点，TNF-α是典型的促炎症细胞因子，其中TNF-α是炎症因子中释放最早的炎性介质，通过活化NF-κB信号通路刺激下游的IL-6、IL-8等炎症因子的合成和释放^[8]，可触发和启动炎症反应，通过阻断TNF-α的表达，能特异性地减轻肺组织的损伤^[9]。本研究显示，随着术后时间的延长，模型组大鼠肺组织W/D、肺泡灌洗液TNF-α水平呈逐渐上升趋势，提示脓毒症急性肺损伤时，促炎介质TNF-α参与肺内组织损伤。通过给予中药和地塞米松干预，W/D及肺泡灌洗液TNF-α水平在术后各时间点均较模型组降低，地塞米松组TNF-α水平较中药组低，提示通腑清营汤虽然抗炎效应不及地塞米松，但减轻肺组织损伤的疗效与地塞米松相当。

随着研究的进展，研究者们发现细胞凋亡也参与脓毒症急性肺损伤炎症反应的过程^[10]。细胞凋亡区别于细胞坏死，是为了维持机体内环境稳定，在一系列凋亡基因的调控下发生的主动、有序的死亡过程^[11]。目前与凋亡相关的信号通路有死亡受体介导的外源性凋亡通路、线粒体介导的内源性凋亡通路和内质网应激介导的内源性凋亡通路3条，其中以Fas/Fas-L为途径的死亡受体信号转导是细胞凋亡的主要通路^[12-13]。有研究者用盲肠结扎穿孔术建立脓毒症急性肺损伤小鼠模型，发现Fas/Fas-L凋亡途径介导的细胞凋亡在脓毒症急性肺损伤的发生发展过程中发挥了重要作用^[14]。脓毒症急性肺损伤发生后，TNF-α大量释放，促使肺泡上皮细胞的死亡受体Fas大量表达，激活Fas/Fas-L凋亡途径，诱导细胞凋亡^[15]。本研究发现，随着术后时间延长，模型组大鼠AI及Fas蛋白水平呈逐渐上升趋势，通过给药干预，中药组和地塞米松组大鼠肺组织AI和Fas蛋白水平降低，但二者无明显差异。提示通腑清营汤可通过下调肺组织Fas蛋白的表达，抑制肺内TNF-α炎症介质的水平，发挥抗凋亡的作用，其作用与地塞米松相似。

综上所述，本研究表明通腑清营汤除可减轻肺组织损伤和抗炎外，其抗细胞凋亡作用可能是减轻脓毒症肺损伤的另一个途径，其机制尚待进一步深入研究。

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（收稿日期：2019-04-22）

（修回日期：2019-06-13;编辑：华强）