新时代高清晰度不同术中冰冻染色流程比较研究

黎济荣 杨晓勇 阳练

[摘要] 目的 探尋适合新时代要求的高清晰度术中冰冻染色流程，并对现存的不同术中冰冻染色流程进行比较研究。方法 2016年10月8日临床送检手术标本，同一块组织按照1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm取材5块，随机分配为微波炉加热组、酒精灯加热组、恒温箱加热组、全自动染色机组、电吹风加热组。每组按标准术中冰冻流程制备100张冰冻病理切片，苏木素染色环节按分组方式各干预2 min，以标准石蜡制片为参照，观察各组冰冻切片组织结构及细胞特征的清晰度差异，按A、B、C、D类片予分类计数并进行统计学处理。 结果 A类片与标准石蜡HE制片效果基本一致，具有检验意义。微波炉加热组A类片占总构成比的56.6%，恒温箱加热组A类片占14.7%，酒精灯加热组A类片占13.2%，全自动染色机组A类片占8.5%，电吹风加热组A类片占7.0%。微波炉加热组A类片显著高于其他组，差异具有统计学意义（P<0.05）。高清晰度术中冰冻制片以微光波技术为基础，完善了染色流程及技术模式。 结论 高清晰度术中冰冻染色流程实际制片效果与标准石蜡切片基本一致，技术流程规范严谨，技术模式系统完整，制片质量稳定可靠，经得起重复试验验证，具有鲜明的新时代特色。

[关键词] 术中冰冻;染色;高清晰度;微光波技术

[中图分类号] R736.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）30-0038-04

Comparative study on different high-definition intraoperative frozen staining processes suitable for new era

LI Jirong   YANG Xiaoyong   YANG Lian

Department of Medical Education， Yongchuan Hospital of Traditional Chinese Medicine of Chongqing Medical University， Chongqing   402160， China

[Abstract] Objective To explore the high-definition intraoperative frozen staining processes suitable for the new era， and to compare the different existing intraoperative frozen staining processes. Methods On October 8， 2016， of the surgical specimens sent for clinical examination， 5 pieces with the size of 1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm were taken from the same piece of tissue and randomly assigned to microwave heating group， alcohol lamp heating group， incubator heating group， full automatic staining machine group and hair dryer heating group. In each group， 100 frozen pathological slices were prepared according to the standard intraoperative freezon process and each group was intervened for 2 minutes with hematoxylin staining. With the standard paraffin slice as reference， the definition differences in the tissue structures and cell characteristics of the frozen slices of each group were observed. The slices were classified into class A， B， C and D， and were calculated and processed statistically. Results The preparation effect of the class A slice was basically the same as that of the standard paraffin HE slice， with statistical significance. In the microwave heating group， class A slices accounted for 56.6% of the total， in incubator heating group， class A slices accounted for 14.7%， in alcohol lamp heating group， class A slices accounted for 13.2%， in full automatic staining unit group， class A slices accounted for 8.5%， and in hair dryer heating group， class A slices accounted for 7.0%. The number of class A slices in microwave heating group were significantly higher than that in other groups， with statistically significant differences （P<0.005）. High-definition intraoperative frozen slice was based on micro-lightwave technology， which improved the staining process and the technical mode. Conclusion The high-definition intraoperative frozen staining process has consistent slice preparation effect with the standard paraffin slice， of which the technical process specification is rigorous， the technical mode system is complete， the production quality is stable and reliable， and it can withstand repeated test verification and has a distinct feature of new era.

[Key words] Intraoperative frozen; Staining; High definition; Micro-lightwave technology

新时代需要高清晰度术中冰冻病理切片[1]。到目前为止国内大多数病理科的术中冰冻病理切片在展示组织结构及细胞特征上清晰度确实不高，常常因此对术中冰冻病理诊断造成较大的识别困扰和诊断风险[2]。为此笔者于多家大型教学医院进修学习，观察到各大医院在术中冰冻染色流程上基本一致，但在一些关键细节上有差异，如苏木素染色环节[3]。有的病理科术中冰冻病理制片时此环节使用酒精灯加热[4]，常规石蜡制片时使用微波炉加热[5];有的病理科为全自动术中冰冻染色机制片，此环节未加热[6];有的病理科此环节使用恒温箱加热[7];有的病理科此环节使用电吹风加热[8]。为了切实比较上述制片效果的差异，笔者对不同术中冰冻染色流程的全部技术细节反复实验测量，包括使用试剂的品种、浓度、作用时间、可能的作用机制等，并按苏木素染色的不同干预方式各制备100张相关病理切片。结果显示苏木素染色环节使用微光波干预的一组制片效果最好，清晰度最高，展示的组织结构及细胞特征与标准石蜡制片效果接近，除部分含水量大的疏松组织因冰晶破坏致制片质量下降[9]。笔者围绕该发现对相关染色流程及技术细节做了全面系统的探索和试验，并作了大量文献复习。

1 材料與方法

1.1 一般材料

实验时间：2016年10月8日;标本来源：当天临床送检的术中活检标本，标本信息核对无误后立即取材，取材时认准典型病变部位[10]。各标本（乳腺癌1例、纤维瘤1例、子宫肌瘤1例、脑1例、肾1例）同一块组织按照1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm取材5块。随机分配给微波炉加热组、酒精灯加热组、恒温箱加热组、全自动染色机组、电吹风加热组， 每组按标准流程制备100张冰冻病理切片，苏木素染色按各组方式干预2 min，以标准石蜡制片为参照，观察各组冰冻病理切片组织结构及细胞特征的清晰度差异。

本次试验采用自身配对设计，前瞻性统计研究，为第一次临床病理试验。严格控制非试验因素，如试剂浓度、作用时间、切片厚度等计量资料。试验切片按中华医学会病理质控中心标准尽量做到[11]：①冰冻组织切面完整;②冰冻切片厚度3～5 μm;③冰冻切片无刀痕、裂痕、颤痕;④冰冻切片平坦、无皱褶折叠;⑤冰冻切片无污染;⑥冰冻切片无气泡;⑦冰冻切片透明度好;⑧细胞膜、细胞质与细胞核染色对比清晰;⑨冰冻切片无松散、粘贴位置适当;⑩冰冻切片整洁，标签端正粘牢、编号清晰。

1.1.1 纳入标准[12]  ①当天送检术中活检组织;②标本送检时间≤60 min;③标本未受任何污染;④标本未经任何试剂固定;⑤标本无任何溶解现象;⑥控制非试验因素，统一标准制片流程;⑦切片评分≥90分（甲级片）;⑧均为首次发病;⑨签署“知情同意书”;⑩医院伦理委员会批准。

1.1.2 排除标准[12]  ①非当天送检术中活检组织;②标本送检时间>60 min;③标本受到污染;④标本已被试剂固定;⑤标本有溶解现象;⑥制片操作未达到标准;⑦切片评分<90分;⑧不愿意配合者;⑨接受过化疗者;⑩预测生存期低于3个月者。

1.2主要实验设备与材料

微波炉（美的EM720KG1-PW）、1L塑料染色杯（微波炉可用）、冰冻切片机（LEICA-CM1950）、冰冻专用刀片（LEICA 819）、冰冻标本包埋剂、95%乙醇、苏木素染液（Harris）、伊红染液（醇溶性）、0.8%盐酸酒精、梯度乙醇（浓度为85%、90%、95%、无水乙醇）、二甲苯、中性树胶、载玻片与盖玻片（世泰）、常规金属玻片架、新鲜标本、纱布等。

1.3 高清晰度术中冰冻染色流程及技术细节

1.3.1 冰冻切片机操作温度  LEICA冰冻切片机机箱温度设为-25℃，恒温待机，标本固定头工作温度设为-25℃，机箱及标本固定头温度必要时可根据组织类型进行调节。脂肪组织需将标本固定头温度调整至-40℃～-50℃，肾组织需将温度调整至-30℃～-40℃才能达到良好的切片效果[13]。

1.3.2 包埋技术细节  取好的标本块，平放于标本托上，用冰冻标本包埋剂（普通胶水）滴加包裹[14]。小标本（直径0.1～0.3 mm）应先在标本托上用标本包埋剂打底，冻硬后再将小标本放上去进行二次包埋。标本包埋要平整，尤其是多粒小标本。

1.3.3 冰冻切片技术细节  标本托放于速冻台上，启动速冻台，当包埋剂底部由透明开始结冻变白时，将标本托移于冰锤盘并盖上冰锤。标本冻硬后移于标本固定头上并切片。常规设置切片厚度为3 μm，必要时可根据组织类型进行厚度调节。疏松结缔组织3～5 μm，脂肪组织5～8 μm。先将标本粗修至最大切面，再细修数次至平滑为止，减少粗修对切面造成的小裂隙。匀速转动手轮进行切片，用带静电毛笔吸拉切片，用载玻片平整吸贴切片。每例标本各切片100张。

1.3.4 染色流程技术细节（试剂均为新配）  （1）将裱好的切片整齐摆放于玻片架上，切片数量一批次可1张至50张不等。（2）将切片放入95%乙醇中30 s。可根据组织类型及切片数量调整浸泡时间，以达到最佳固定效果及脱水效果为准。（3）将切片放入玻璃缸中，流水冲洗10 s，稀释乙醇，减少对苏木素染色的影响。（4）甩掉切片及切片架水分，放入塑料染色杯，杯内盛放新鲜苏木素500 mL，敞口放入微波炉中加热2 min。微光波的作用不仅能对染液加温，还能由内至外固定细胞和组织，使切片的组织结构及细胞特征更清晰地展示[7]。（5）将切片放入玻璃缸中，流水冲洗20 s。（6）将切片放入0.5%盐酸酒精中2 s。可根据组织类型及切片数量调整分化时间，以达到最佳分化效果为准。（7）将切片放入玻璃缸中，流水冲洗20 s。（8）将切片放入热水中返蓝30 s。可根据组织类型及切片数量调整分化时间，以达到最佳蓝化效果为准。（9）将切片放入伊红染液中2 s后提出。由于伊红染色较快，可将切片适度平放，视觉监控伊红染色进度，达到标准时，切片呈蓝紫色。（10）放入玻璃缸中，流水冲洗10 s。（11）甩掉切片及切片架水分，梯度乙醇脱水（共2 min），二甲苯透明（共2 min）。（12）中性树胶封片，滴加时精控滴量，避免因覆盖不全及溢出影响美观和使用。最后贴上标签。

1.4 评片标准[15]

冰冻染色制片质量按4类片评定。A类片：组织结构清晰，细胞特征清晰。B类片：组织结构清晰，细胞特征不清晰。C类片：组织结构不清晰，细胞特征清晰。D类片：组织结构不清晰，细胞特征不清晰。术中病理诊断按常规4类报告评定。

1.5统计学处理

采用SPSS17.0软件进行分析。计量资料用（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 高清晰度术中冰冻制片实际效果展示（微光波干预——以乳腺导管癌为例）

微波炉加热组A类冰冻切片显示清晰度高。组织结构层次及细胞特征明显，色彩鲜艳，图像线条勾画锐利。不同的组织类型及肿瘤细胞对比度显著，容易辨识清楚。单个细胞显示尤佳，立体感强。细胞结构表达精细，细胞膜、细胞浆、细胞核以及细胞核的微细结构如核膜、核仁、染色质颗粒、染色体、核分裂及对称性等进步能良好地表达。实验展示的组织结构层次及细胞特征与标准石蜡HE制片效果基本一致。见封三图1～4。

2.2 5种术中冰冻染色流程制片效果比较

微波炉加热组A类片占总构成比的56.6%，恒温箱加热组A类片占14.7%，酒精灯加热组A类片占13.2%，全自动染色机组A类片占8.5%，电吹风加热组A类片占7%。微波炉加热组A类片显著高于其他组。见封三图5、6。

2.3基于A类片，各实验组间的两两比较

A类片组织结构清晰，细胞特征清晰，接近标准石蜡制片效果，具有检验意义，计数资料采用χ2检验。本次试验，微波炉加热组与酒精灯加热组、恒温箱加热组、全自动染色机组、电吹风加热组比较，差异具有统计学意义（均P<0.005）。酒精灯加热组与恒温箱加热组、全自动染色机组、电吹风加热组比较，差异不具有统计学意义（均P>0.05）。全自动染色机组与恒温箱加热组、电吹风加热组比较，差异不具有统计学意义（均P>0.05）。另恒温箱加热组与电吹风加热组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

3 讨论

3.1 术中冰冻文献与术中冰冻技术文献发表数2009～2018年度分布（基于CNKI）

2009～2018年术中冰冻切片技术相关文献的发表数在整体上呈增加趋势，从2014年开始有一个显著的上升，至2016年出现第一个小高峰。2009～2018年术中冰冻文献的总发表数在整体上略呈下降趋势，2018年术中冰冻相关文献发表数为10年历史最低。见封三图7。

3.2高清晰度術中冰冻染色流程深析

从2009～2018年术中冰冻相关文献显示，术中冰冻制片质量确实在逐年提高，但清晰度与标准石蜡切片比对仍有较大差距[16]。到目前为止，还未见比较成熟系统、革命性改变的冰冻切片制作技术报道。而科技与学术的快速发展已促使社会进步到了一个新的时代，高清晰度术中冰冻染色流程能满足手术医师、手术患者、病理医师的迫切需求[17]。快速病理诊断是手术医师在手术中决定手术方案的金标准，术中冰冻病理诊断也是病理科采用最多的检验方案，其特点就是“短、准、快”。临床医师最关注的就是诊断准确，也是其价值意义所在。诊断准确不但要求病理医师具备系统扎实的医学功底和丰富有效的临床经验，而且术中冰冻切片的清晰度也决定了冰冻病理诊断的准确性和可靠性。

高清晰度术中冰冻切片的制作：首先，要避免组织溶解、组织污染、组织破坏等干扰因素。标本应去除多余脂肪、毛发、线头、钙粒或骨碎片及其他硬物。取材时用纱布吸取标本表面水分，作简单的物理脱水。取材刀锋利无损能减少组织损伤，提高取材质量。其次，为减少冰晶形成，应避免取材过厚过大及冰冻过慢过长。如肾脏组织质地嫩脆，冰冻过慢时间太长，切片易碎且组织细胞形态变形严重。究其原因是水结晶时分为两种结晶态，即玻璃态与晶体态。将切片机机箱温度设为-25℃的意义在于迅速将标本冰冻，速冻台与冰冻锤的配合进一步加快冰冻速度，使接触面标本尽量呈玻璃态结晶，减少冰晶对组织结构的影响[9]。然后冰冻切片用95%乙醇作适度脱水及从外到内的渗透性固定。苏木素环节用微光波干预，在加温染液的同时作由内至外的细胞组织固定。因此冰冻切片实际上是经过简单有效的组织固定及脱水处理的，故制片效果与标准石蜡切片基本一致。最后染色是制作和诊断的关键，其影响因素较多，如染液的使用次数、染液温度、染色时间、切片厚度面积等。陈锦等[15]研究显示染液温度颇为关键，过高及过低均不好，以35℃为宜。因此，微光波对染液的加温时间决定了染液温度，过长和过短均不好，以2 min为宜。

与其他试验组比较，本次试验微波炉加热组A类片显著高于其他组，经χ2检验，P<0.005，差异具有统计学意义。微波炉加热组B类片集中于致密的纤维肌肉组织，微波炉加热组C类片集中于含水量大的疏松组织如脑组织、肾组织等，因受冰晶影响严重，组织结构显示较差。微波炉加热组D类片出现于玻片挨挤处，影响了试剂作用效果。酒精灯加热组、全自动染色机组、电吹风加热组的B类片较多，制片效果倾向于组织结构清晰，细胞特征模糊。恒温箱加热组C类片较多，制片效果倾向于细胞特征清晰，组织结构模糊。电吹风加热组D类片较多，是由于加热时影响因素过多，如受热距离、风速、吹风角度等，增加了操作难度，导致制片质量不稳定。酒精灯加热组、全自动染色机组与恒温箱加热组在整体制片质量上没有显著差异。笔者围绕该发现，对不同术中冰冻染色流程的操作步骤及技术细节做了全面系统的探索和试验，并作了大量文献复习，然后以微光波技术为基础，完善了高清晰度术中冰冻染色流程的技术模式。

高清晰度术中冰冻染色流程受到常规石蜡制片流程的启发，以术中冰冻制片的实验条件，模拟了标准石蜡制片流程的核心概念，简化了相关操作步骤，并取得了良好效果，制片质量大幅度提高。其中技术难题之一为术中冰冻切片的有效组织固定，因微光波技术的使用和恰当浓度乙醇的应用得到初步解决。近期文献刘宪军[18]的超声波技术在术中冰冻病理切片制作中的应用对相关组织固定机制做了阐述。微光波技术与超声波技术的组织固定原理接近，即加速水分子及组织分子的规律运动产生热效应及良好的固定效果，但微光波技术的固定效果更好一些。另一个技术难题是精细化的组织脱水程度控制，由恰当浓度乙醇的应用及梯度酒精技术的使用得到初步解决，实际脱水效果接近石蜡制片效果。通过不断地改进和提高对术中冰冻制片技术的理论认知成熟度及实际制片效果，高清晰度术中冰冻染色流程趋于规范严谨，技术理论系统完整，制片质量稳定可靠，经得起重复试验验证，其发现的意义在于虽然目前的技术流程还不够精细，但使临床病理工作者看到了高清晰度术中冰冻病理制片的曙光，可能由此打开一个术中冰冻病理诊断的新时代。在更优越的实验条件下，高清晰度术中冰冻染色流程应该会有一个更大的持续的发展。

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（收稿日期：2019-06-27）