猪骨髓间充质干细胞体外构建软骨修复关节软骨缺损的实验研究

宋楠 何爱娟

软骨缺损临床较为常见，因其自我修复能力低，多需进行自体软骨移植以重建关节功能[1-3]。组织工程技术为关节软骨缺损修复提供了崭新的思路，有望解决目前关节软骨缺损修复面临的困难。

BMSC 具有软骨形成能力强、来源广泛、获取损伤轻、无供区缺损、可重复取材等优势，是关节软骨缺损修复的理想种子细胞。前期研究已证实，应用BMSCs 复合聚羟基乙酸/多聚乳酸（PGA/PLA）可成功修复大动物关节软骨缺损[4-5]，但软骨体内再生的稳定性不足，成功率较低。另有研究表明，大量PGA支架材料及其降解产物在体内可引发炎症反应，从而干扰软骨的体内再生。因此，将BMSCs 复合PGA/PLA 支架体外共培养，待支架材料大部分降解后再植入体内，或可获得更为理想的修复效果。然而，目前仍不清楚BMSCs 体外构建软骨植入体内后是否能进一步成熟并修复软骨缺损。

为此，我们以猪为实验动物，建立大面积关节软骨缺损模型，用自体BMSCs 体外构建的软骨移植修复缺损，评估BMSCs 体外构建软骨修复关节软骨的可行性及其长期功能转归，并同时检测关节液中IGF-1、IL-1β、MMP-13 及TNF-α 的表达，以初步阐述该方法是否可避免或延缓骨关节炎的发生、发展。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

普通健康长枫杂交猪（上海青浦养猪场），4～6 月龄，体质量15～30 Kg 不等，雌雄不限（n=7）。后肢膝关节股骨内外侧髁制备直径10 mm 的全厚软骨缺损，以BMSCs 体外构建软骨进行修复（实验组，n=7）；创面旷置作为空白对照组（n=3）；单纯PGA/PLA 材料修复作为单纯材料组（n=5）；正常关节作为正常对照组（n=13）。

1.2 实验材料

DMEM 培养液、ITS（Gibco，美国）；L-谷氨酰胺、维生素C、0.25%胰蛋白酶（Sigma，美国）；青霉素、链霉素（上海新华制药厂）；10%胎牛血清（HYCLONE，美国）；100 mm 培养皿、0.22 μm 目滤器、50 mL 离心管、6 孔培养板（Falcon，美国）；TGF-β1（每支20 μg，Intergen，美国）；IGF-1（每支50 μg，Intergen，美国）；地塞米松（2 mg/mL，Sigma，美国）；非编织聚羟基乙酸纤维（PGA，上海国睿生命科技有限公司）；单克隆抗体ab34712（Abcam，英国）。

1.3 BMSCs 分离培养及扩增

每只实验动物抽取10 mL 骨髓，全血培养法培养BMSCs 原代细胞[6]。将接种好的培养皿置于37 ℃、5%CO2、100%饱和湿度条件下培养5 d 后首次换液，加入PBS 缓冲液反复漂洗，去除未贴壁血细胞，加入新鲜培养液继续培养。待细胞接近70%～80%融合时进行传代培养。收集第2 代细胞用于后续实验。

1.4 PGA/PLA 支架材料的制备

取非编织聚羟基乙酸（PGA）15 mg，放入圆形注射器中，加入少许无水乙醇将其压制成型，滴加1%（1 g 的PLA 溶于100 mL 的二氯甲烷）的PLA 塑形，制成直径10 mm、厚度2 mm 的PGA/PLA 支架。将制备好的支架材料灭菌后预培养48 h，确定无污染后用于细胞接种。

1.5 细胞-材料复合物的制备

第2 代BMSCs 离心弃上清，新鲜培养液重悬细胞，调整细胞浓度为50×106cells/mL。以无菌滴管吸取细胞悬液均匀滴种在支架材料上（每块材料接种约0.1 mL 细胞悬液），置于37 ℃、5%CO2、100%饱和湿度下孵育4 h，加入含10%FBS 的DMEM 培养液培养2 d，换软骨诱导液（含0.3 g/L L-谷氨酰胺、0.05 g/L抗坏血酸、3.7 g/L 碳酸氢钠、10 万U/L 青霉素钾、0.1 g/L 硫酸链霉素，10 ng/mL TGF-β1、100 ng/mL IGF-I、1%ITS、40 ng/mL 地塞米松的高糖DMEM 培养液）进行软骨定向诱导。每隔2 d 全量换液，倒置显微镜观察细胞基质分泌情况，以及与PGA 纤维的黏附情况。

1.6 构建软骨的大体观察、组织学检测

细胞材料复合物体外培养8 周时，每只动物各取1 个样本进行大体观察和组织学检测。HE 染色观察细胞形态；Safranin-O 染色观察细胞外基质中GAG 的合成和分泌情况；免疫组化观察细胞Ⅱ胶原蛋白的合成和分泌情况[6]。

1.7 缺损修复

实验组用体外诱导了8 周的组织工程软骨植入缺损处，5-0 可吸收缝线缝合固定（图1）；空白对照组创面旷置；材料对照组以PGA/PLA 材料修复缺损；以正常关节作为正常对照组。

图1 关节软骨缺损的修复模型Fig.1 Repair model of articular cartilage defect

1.8 组织学检测

术后6 个月取材行大体观及组织学检测。大体观察修复区软骨的大小、形态、色泽、表面情况、修复厚度及其相邻正常关节软骨的界面愈合情况，同时沿软骨修复区中线锯开关节，观察修复区软骨与软骨下骨的界面愈合情况。

HE 染色观察修复区有无软骨细胞修复、细胞排列情况、与周围正常关节软骨及软骨下骨的界面愈合情况、修复区域的厚度及平整度、细胞外基质的沉积情况等。

1.9 关节液细胞因子检测

术前及术后6 个月时抽取猪关节液，检测关节液的IGF-1、IL-1β、MMP-13 及TNF-α 因子的表达水平（n=3）[6]。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 BMSCs 体外构建软骨大体观及组织学检测

体外软骨构建8 周后，实验组修复处形成了表面光滑、瓷白色的软骨样组织。HE 染色可见明显的软骨陷窝结构，陷窝周围均有蓝染的细胞外基质沉积；Safranin-O 染色及免疫组化显示，软骨陷窝周围有大量的GAG 及Ⅱ型胶原蛋白沉积。这些结果说明体外诱导8 周后，BMSCs 已形成了成熟的软骨组织，并能大量分泌软骨特异性细胞外基质（图2）。

图2 BMSCs 体外构建软骨大体观及组织学检测Fig.2 Gross observation and histological detection of cartilage constructed by BMSCs in vitro

2.2 软骨修复大体观

实验组缺损区均有新生软骨组织形成，其表面光滑，色泽、质地、强度与周围正常软骨类似。剖面观可见新生软骨组织与周围正常软骨组织及软骨下骨组织界面愈合良好，且修复区软骨厚度与周围正常关节软骨未见明显差异。单纯材料组缺损边缘虽有少量软骨细胞爬入，但中央区主要表现为纤维结缔组织样组织修复，关节面软骨负重区多有磨损变薄、软骨下骨隐约可见，出现骨关节炎表现。这些结果说明，BMSCs 体外构建软骨可修复自体关节软骨缺损，可有效避免或延缓骨关节炎的发生。统计修复率结果显示，实验组基本修复；单纯材料组仅1 例有部分缺损修复；空白对照组均无修复（图3、4）。

图3 术后6 个月取材大体观及剖面观Fig.3 Gross and cross section view of repaired defects 6 months after operation

2.3 骨关节炎相关细胞因子检测

术后6 个月，实验组关节液中IGF-1 水平显著高于空白对照组和单纯材料组（P＜0.05）；而IL-1β、MMP-13、TNF-α 的表达显著低于空白对照组和单纯材料组（P＜0.05）。提示BMSCs 体外构建软骨不仅可以修复关节软骨缺损，还能有效减缓或避免骨关节炎的发生、发展（图5）。

图5 关节液中细胞因子的变化情况Fig.5 Changes of cytokines in joint fluid

3 讨论

组织工程技术修复关节软骨缺损尚停滞于临床前的大动物实验阶段。本研究发现，应用BMSCs 体外构建的组织工程软骨可成功修复猪自体的关节软骨缺损，且新生软骨组织与周围正常的骨、软骨组织界面愈合良好，其组织学特性与天然软骨也十分接近。更重要的是，组织工程软骨修复软骨缺损后能有效减缓或避免骨关节炎的发生和发展。

软骨损伤是常见的运动损伤之一，尤其是关节软骨损伤。随着人口老龄化趋势的发展，关节炎导致的软骨缺损也在逐年剧增。本研究发现，利用猪自体的BMSCs 可在体外构建成熟稳定的软骨组织，同时根据缺损的大小与形状，还可以在体外构建出个性化的具有特定形态且功能正常的软骨组织；且这些组织工程软骨能有效修复自体关节软骨缺损。这为组织工程软骨的临床应用提供了理论基础。

尽管大部分BMSCs 构建的软骨植入体内后都获得了较为理想的软骨再生效果，但我们也发现实验组中有些个体的修复效果未尽如人意，出现了纤维结缔组织样修复并伴有骨关节炎样表现。根据既往文献报道，我们推测导致软骨缺损修复效果欠佳的原因可能有以下几方面：①软骨下骨出血。为了能植入厚度约为3 mm 的软骨组织，术中我们刮除了厚度约0.5 mm 的软骨下骨组织。刮除软骨下骨过程中出血量大，止血困难，将组织工程软骨植入软骨缺损区后，软骨下骨仍继续出血，直至将软骨充分固定后出血才停止。因此，植入的组织工程软骨与软骨下骨之间有较大的血肿存在。文献报道，软骨修复手术造成的滑膜、软骨下骨出血会刺激创面大量白细胞渗出并释放大量的炎症因子，而导致软组织反应性水肿和关节积液；此外，关节内积血还导致纤溶酶激活。这些因素破坏了关节内环境的稳态[7]。软骨由于没有血供，营养来源于关节液，关节内环境的紊乱干扰了软骨、软骨下骨的正常营养成分供给，导致软骨无法获得正常的营养，从而影响植入软骨的进一步成熟[8]，影响修复效果。②手术创伤过大，植入物缺乏合适力学刺激微环境。本研究中，实验动物的双侧膝关节的股骨髁均同时做了大面积（直径10 mm）全厚软骨缺损，损伤较大。软骨基质中的GAG 有吸水膨胀的特性，使得软骨像海绵一样，在不受到压力时能源源不断地将关节液中的营养成分吸入软骨组织内，而在受压变形时又可将代谢产物与关节液挤出软骨组织从而排出代谢产物。因此，适当的力学刺激对软骨的营养代谢至关重要。但是，术后软骨下骨淤血、关节腔内积液等不仅引起关节腔内结缔组织增生、黏连，还可引起关节腔内压、骨内压增高[9-10]，加重了实验动物术后的疼痛感，导致实验动物活动减少，进一步加重了术后关节黏连[11]。由于缺乏合适的力学刺激，从而大大影响了软骨营养物质的摄入及代谢产物的排出。这些因素相互作用加重了关节内环境紊乱，严重影响植入软骨的营养代谢和物质运输，从而影响修复效果。③另一个重要影响因素是动物术后负重过早。由于实验动物双下肢的内外侧髁同时做软骨修复手术，为维持基本生活，大部分实验动物于术后1 周内开始负重，而目前临床上自体关节软骨移植手术普遍实行术后早期被动活动、术后6 周开始负重。从体外构建软骨的弹性模量来看，体外构建8 周的软骨，其弹性模量只达到正常关节软骨的30.61%，抗压强度远低于正常关节软骨，这间接说明了体外构建的软骨并不足以承重[12-14]。因此，术后负重过早或导致了植入的软骨受到过大的压强，使其胶原纤维断裂、结构破坏，而影响修复效果。

综上所述，本实验证实了应用自体BMSCs 体外构建的组织工程软骨，能有效修复猪膝关节大面积全厚关节软骨缺损，但是由于受手术创伤、术后关节内环境变化、过早负重等因素影响，其修复效果有待进一步提高。此外，影响关节修复效果的关键因素及其作用机制仍需进一步验证。本研究为组织工程软骨的临床应用提供了重要的实验基础。