高效液相色谱法同时测定赤芍中没食子酸、没食子酸丙酯和柚皮素的含量

张海生，王思琦，佘胜楠，周丽红，丁俞珍，冯春来

(江苏大学药学院，江苏 镇江 212013)

赤芍是毛茛科植物芍药或川赤芍的干燥根，具有清热凉血，活血祛瘀的功效[1]。其活性成分主要为萜类及其苷、鞣质类、挥发油、黄酮及其苷等[2-5]。现代药理学研究表明，赤芍具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、抗炎和抗病毒等多种药理作用[6-10]。研究证实，赤芍中所含有的柚皮素、没食子酸和没食子酸丙酯具有抗氧化、抗肿瘤等一系列药理活性[11-26]。虽然目前已有不同药材中柚皮素、没食子酸和没食子酸丙酯的含量测定方法，但尚未建立同时检测药材中这三种活性成分的方法。因此，建立一种同时检测赤芍中没食子酸、没食子酸丙酯和柚皮素含量的检测方法对于赤芍药效物质研究以及药材质量控制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；InertSustainTMODS-C18色谱柱(上海岛津实验器材有限公司)；XT120A型电子天平(瑞士Precisa公司)。对照品购买自国药集团，没食子酸质量分数≥99%，没食子酸丙酯和柚皮素质量分数≥98%，甲醇和乙酸购买自国药集团(色谱纯)；赤芍药材(安徽亳州，经江苏大学药学院欧阳臻教授鉴定为毛茛科植物芍药的干燥根)；超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取20 mg对照品没食子酸、没食子酸丙酯和柚皮素，并分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到质量浓度为2 mg/mL的三个活性成分对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取10 g赤芍粉末，置于250 mL圆底烧瓶，按照料液比1 ∶10加入100 mL超纯水，40 ℃超声提取1 h，提取液经3 700 r/min离心20 min，取上清液备用[27-29]。

1.2.3 色谱条件 色谱柱为C18色谱柱，流动相为甲醇-0.1%乙酸水溶液，体积流量1.0 mL/min，梯度洗脱(0～10 min为90%乙酸水溶液-10%甲醇等度洗脱；10～30 min，由90%乙酸水溶液向50%乙酸水溶液梯度洗脱；30～60 min，50%乙酸水溶液-50%甲醇等度洗脱)，检测波长270 nm，柱温30 ℃，进样量为20 μL。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

分别量取三个活性成分的对照品溶液4 mL于玻璃比色皿中，在200～400 nm波长范围内进行紫外全波长扫描，如图1，三个活性成分在240～280 nm内均有良好吸收，没食子酸，没食子酸丙酯和柚皮素的最大吸收波长为270 nm，因此确定检测波长为270 nm。

图1 三个活性成分紫外全波长扫描图

2.2 色谱条件考察

按照“1.2.3”项下的色谱条件进样，得到没食子酸、没食子酸丙酯和柚皮素的保留时间分别为8.6、41.7和54.0 min(图2)，样品与对照品在相同保留时间有同样的峰，且三个样品分离度良好。

A：样品；B：混合对照品

2.3 线性关系考察

精密吸取“1.2.1”项下三个活性成分的对照品溶液，配制三个成分浓度均为5、20、50、100、150、200和250μg/mL的混合甲醇溶液，按照“1.2.3”项下色谱条件进样测定，得到不同成分不同浓度的峰面积，计算得到三个活性成分的标准曲线。由图3可以看出三个活性成分在5～250 μg/mL的浓度范围内浓度与峰面积成线性正相关，且R2均>0.999。说明方法准确可靠，线性关系良好。

图3 没食子酸、没食子酸丙酯及柚皮素的含量测定标准曲线

2.4 精密度试验

取“1.2.1”项下对照品溶液，分别取低(5 μg/mL)、中(100 μg/mL)、高(250 μg/mL)三个浓度进行精密度试验。在“1.2.3”项下色谱条件下，每个活性成分每个浓度每天测量5次，计算日内精密度(表1)。同时每天测量1次，连续测量5 d，计算日间精密度(表2)。结果表明，混合三个活性成分的日内精密度和日间精密度的RSD均<2%，说明精密度良好，方法准确可靠。

表1 三个成分混合物的日内精密度结果

表2 三个成分混合物的日间精密度结果

2.5 加样回收试验

精密配制含有三个活性成分100 μg/mL混合储备液备用。分别加入相当于原药物量的80%，100%，120%的对照品溶液，计算三个活性成分的回收率。在“1.2.3”项下色谱条件下进样，计算得到的实验结果见表3，三个活性成分的回收率均在99%～102%之间，且三个活性成分回收率的RSD均<2%，说明回收率较好，方法准确可靠。

表3 三个成分混合物的回收率结果

2.6 样品测定

在“1.2.3”项下色谱条件下，取供试品溶液20 μL进行高效液相色谱测定，根据标准曲线计算三个活性成分的含量，重复测量3次。通过计算得到三个成分的含量，其中没食子酸的含量最高，没食子酸丙酯次之，柚皮素含量最低。由表4可看出每1 g赤芍生药中没食子酸，没食子酸丙酯，柚皮素平均含量分别为1.867，0.561，0.093 mg，且含量的RSD分别为0.62%，1.46%，1.08%。

表4 赤芍中三个活性成分的含量

3 结论

本研究建立了一种同时测定赤芍中没食子酸，没食子酸丙酯，柚皮素三个活性成分的高效液相色谱方法，确定检测波长为270 nm，建立了三个活性成分的标准曲线。该方法简单高效同时测定三个活性成分，为其他含有没食子酸，没食子酸丙酯和柚皮素的中药的含量测定与检测提供参考。同时运用该方法对赤芍提取液进行了含量测定，发现赤芍中没食子酸，没食子酸丙酯，柚皮素三个活性成分的含量分别为1.867，0.561，0.093 mg/g，且RSD分别为0.62%，1.46%，1.08%，该方法的建立对赤芍药材质量控制具有重要意义。