一种快速建立小鼠心肌缺血再灌注模型的方法

臧光耀，李波，耿田欣，严金川

(江苏大学附属医院心内科，江苏 镇江 212001)

2017年中国心血管病报告显示，我国心血管疾病仍然是严重威胁居民生命健康的首要疾病，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是其中常见的致死病因[1]。溶栓、冠脉介入和搭桥等再灌注治疗可明显改善AMI患者的预后，但心肌缺血再灌注会诱发一系列明显的组织损伤和无菌性炎症反应，影响患者预后[2]。因此，建立稳定有效的小鼠心肌缺血再灌注模型有助于为研究AMI提供可靠的依据。

以往的心肌缺血再灌注模型多集中于兔、猪等动物，近年来大鼠模型的应用逐渐增多。但小鼠繁殖力强、便于养殖，并且近年来基因敲除小鼠得到广泛应用，用小鼠建立心肌缺血再灌注模型对研究AMI和心肌缺血再灌注的损伤和修复具有重要意义[3-4]。目前国内对小鼠心肌缺血再灌注模型的建立报道较少，且建立过程中需要对动物进行通气辅助呼吸操作并二次开胸，耗时长，对动物损伤大，极易造成动物死亡。本研究针对以上问题，参照国内外已有的模型构建方法[5-7]，探讨一种无需借助呼吸机和开胸操作的方法建立心肌缺血再灌注模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

40只健康SPF级昆明小鼠，雄性，体重18～25 g，6～8周龄，购于江苏大学动物实验中心，动物合格证编号:201924287。随机分为假手术组、缺血15 min+再灌注24 h组、缺血30 min+再灌注24 h组和缺血45 min+再灌注24 h组，每组10只。本研究经江苏大学附属医院伦理学委员会批准同意。

1.2 仪器和试剂

手术缝合线、显微外科手术器械、XR300小动物麻醉机、XR-RM6240小动物心电图机(上海欣软信息科技有限公司 )；小动物手术灯、异氟烷、75%乙醇、2% TTC染色剂、0.5%伊文思蓝 (Evans Blue) 染色液均为北京索莱宝科技有限公司产品。

1.3 模型建立

手术过程如下： ① 小鼠用2%异氟烷麻醉后仰卧固定于手术台上，小鼠痛觉消失后，接上心电图机获得稳定的Ⅱ肢体导联。② 消毒小鼠胸部毛发，在胸骨左侧第3、4肋间沿胸大肌边缘做一长1 cm左右切口，钝性分离皮下组织、胸大肌和前锯肌，用蚊式镊穿过第3、4肋间，快速挤出心脏。③ 在光源下，于左心耳下1～2 mm处找到冠状动脉左前降支(LAD)，选用6-0丝线，结扎LAD，进针深度约1 mm，宽度1～2 mm，避免穿透心脏。结扎线打成活结，近针端剪短，远针端线头留3～4 cm于胸腔外。假手术组仅穿线不结扎。④ 结扎后可见结扎处以下心室壁变成暗红色，将心脏缓慢推入胸腔内。挤出胸腔内气体，胸壁切口作一荷包结打紧，关上胸腔，将结扎线头留于胸外用于冠脉再通。 ⑤ 结扎后5 min内密切观察心电图改变。⑥ 拿下麻醉面罩，小鼠会在2～3 min内苏醒，整个构建心肌缺血的时间控制在1 min内完成； ⑦ 手术组小鼠分别于缺血15、30和45 min后，缓慢拉出结扎线，恢复心肌血流供应。⑧ 24 h后，记录心电图数据并进行伊文思蓝-TTC染色。

1.4 伊文思蓝-TTC染色

再灌注24 h后，将小鼠麻醉接呼吸机维持呼吸，开胸后重新结扎LAD，迅速分离出主动脉弓，在主动脉弓上做一切口，将1 mL注射器固定于主动脉内，将0.5%的伊文思蓝溶液注入心脏；约1 min后剪下心脏，迅速放入生理盐水中反复冲洗，将心腔内血液洗干净，并快速将心脏放入-80 ℃冰箱中冷冻8～10 min后取出，沿与心脏长轴垂直平面，用手术刀片由心尖部到心底部将心脏切为约1 mm切片5～6片。将切片解冻后放入TTC溶液中，并放入37 ℃环境中避光孵育4～5 min后取出，干燥后放入4%多聚甲醛溶液中固定12 h。固定结束后拍照，并用Image J软件计算梗死区(IA)、缺血危险区(AAR)和心肌总面积(左心室面积，LV)。参考文献[8]方法，用IA/(AAR+IA)来评价心肌梗死的面积，用(AAR+IA)/LV评价缺血区面积。

2 结果

2.1 小鼠造模成功率

40只小鼠手术过程中，假手术组存活率100%，手术组中由于缝合针进针太深导致心脏出血死亡小鼠1只，术后胸腔排气不完全导致气胸死亡小鼠2只，术后取材伊文思蓝-TTC染色结果显示未成功结扎LAD小鼠1只。手术组小鼠存活率90%，缺血再灌注造模成功率 86.7%(26/30)。

2.2 形态学改变

成功结扎LAD后，可见结扎线以下心脏呈灰白色，心脏搏动频率和幅度减弱。再灌注24 h开胸可见与周围组织分界明显的苍白梗死区。见图1。

图1 结扎LAD后心脏形态变化

2.3 伊文思蓝-TTC染色

如图2所示，梗死的心肌组织呈白色，不能被伊文思蓝和TTC染色；危险区呈红色，被TTC染色，不能被伊文思蓝染色，代表缺血但是还活着的心肌组织，可作为缺血再灌注损伤指标；远端区呈蓝色，被伊文思蓝和TTC同时染色，代表正常心肌组织。缺血45 min+再灌注24 h组小鼠IA/(AAR+IA)为(46.7±5.77)%，(AAR+IA)/LV为(63.8±6.36)%。

图2 小鼠心肌缺血再灌注后心脏伊文思蓝染色

2.4 小鼠心肌缺血再灌注前后心电图变化

心电图检测显示，与手术前相比，LAD结扎5 min后小鼠出现T波高耸，ST段抬高，QRS波增宽。随着再灌注时间延长，ST段逐渐回落。见图3。

图3 小鼠心脏结扎LAD前后心电图改变

3 讨论

急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)一直以来是威胁人类健康的主要疾病之一，致死及致残率极高，AMI是其中最常见的类型[9]。尽管近年来我国胸痛中心建设成绩显著，溶栓、冠脉介入等再灌注治疗时间不断缩短，心肌梗死的救治成功率越来越高，但心肌缺血再灌注带来的组织损伤和无菌性炎症依然存在，对其治疗靶点和发病机制的探索越来越引起学界的关注[10]。目前，再灌注损伤中的发病机制研究主要通过羊、猪、兔、大鼠等动物模型来分析。但由于基因敲除小鼠的广泛应用及小鼠成本低，饲养周期短，繁殖力强等优点，小鼠被越来越多地应用于心肌缺血再灌注损伤的研究。

小鼠体型小，传统方法建立心肌缺血再灌注模型时，需术中开胸，并且需要借助呼吸机维持小鼠术中的呼吸，插管、开胸、拔管和缝合胸壁等过程耗时长，容易造成小鼠死亡。本实验造模过程中不使用呼吸机，不需要开胸、插管和拔管，节省了手术时间，与以往模型建立方法相比[5-6,11]，效率大大提升，小鼠成活率高。本次实验中，使用该造模方法，小鼠存活率可达90%，缺血再灌注模型造模成功率86.7%。并且该手术方法操作迅速，心脏显露时间短，最大程度地减少了手术所造成的损伤，有助于小鼠术后的恢复，能够减少手术过程对后续实验造成的影响，适合同时建立一批大数量的小鼠模型进行实验研究。

该模型中准确、快速结扎LAD是实验成功的关键，需要重视以下几点：① 结扎部位的选择。大多数文献报道中，结扎部位通常以左心耳下缘为标志，在其下1～2 mm处做结扎，但较难控制，结扎部位过高会导致小鼠心律失常，严重时会导致小鼠心脏骤停猝死。实验中，我们借助小动物手术灯，在左心耳下缘寻找到冠状动脉左主干分出的LAD和左回旋支分叉处形成的“倒Y型”分叉，结扎沿心脏长轴走行的LAD可提高模型成功率。② 结扎线的选择。实验中我们尝试使用5-0、6-0、7-0、8-0、9-0的手术缝合线对LAD进行结扎，结果发现8-0以上的缝合线在结扎时极容易造成心脏组织损伤，收紧缝合线时容易使心脏组织断裂，5-0缝合线结过大，后期抽线进行再灌注时不易使活结松开，易将组织一起抽出心脏，造成模型构建失败。③ 前期缺血时间的选择。大多数文献中对心肌缺血再灌注结扎时间的选择都在30～120 min内[4,11-12]，我们在实验中，设立了不同缺血时间对照组，观察组织染色结果，最终确立缺血45 min、再灌注24 h适合构建小鼠心肌缺血再灌注模型。

综上，本实验改进了通过结扎冠状动脉建立小鼠心肌缺血再灌注模型的方法，操作过程中，不需要借助呼吸机，胸腔显露面积小、时间短，心电图和组织染色等方法判断模型建立成功。同时，改进后的手术造模时间短，因此可用于快速建立批量模型做大样本量研究。