67例住院腹泻患者艰难梭菌感染情况分析

2019-12-26卢莹莹钱景荣吕博文李文辉

国际检验医学杂志 2019年24期

王杰，卢莹莹，钱景荣，吕博文，李文辉

(哈尔滨医科大学附属肿瘤医院检验科，黑龙江哈尔滨 150081)

艰难梭菌是一种革兰阳性、厌氧、产毒的芽孢杆菌，它反映了该物种在分类学上与梭状芽孢杆菌属其他成员之间的差异[1-2]。艰难梭菌的孢子通过粪-口途径传播，病原体广泛存在于环境中。大约5%的成年人和15%～70%的婴儿存在艰难梭菌定植，在住院患者或疗养院居民的定植患病率高出数倍[3]。1935年研究者首次从健康新生儿的粪便中将艰难梭菌分离出来，直到20世纪70年代，它仍被认为是一种罕见的微生物，但存在于正常的肠道微生物群中。抗菌药物使用后,艰难梭菌在肠道疾病中有更高的发病率[4-5]。1974年有研究发现，接受克林霉素治疗的患者中有21%出现腹泻，经进一步内窥镜检查，50%的病例可见假膜[4]。在20世纪末，艰难梭菌感染(CDI)的发生率明显增加[6]。目前，CDI已成为严重的医院内病原菌感染之一。

CDI的危险因素主要包括近一段时间使用抗菌药物、高龄、应用质子泵抑制剂、长时间住院、基础疾病及免疫功能受损[7]。CDI是大型医院爆发疫情的一个常见原因，治疗费用昂贵，造成医疗系统财政负担沉重[8-9]。国内对艰难梭菌引起相关疾病的报道不多，检出的阳性率存在差异。尽早识别与检测艰难梭菌，了解其危险因素，有针对性地防治，对减轻临床诊疗和疾病负担具有重要意义。因此，为了解哈尔滨地区CDI情况，对临床资料进行回顾性分析，对预防和控制CDI提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1标本来源收集2018年1-12月哈尔滨医科大学附属肿瘤医院住院腹泻患者的粪便标本共67份，入组患者住院期间均应用抗菌药物治疗，抗菌药物使用时间最短1 d，最长25 d，且住院期间发生腹泻，即24 h内有3次或3次以上未成形大便。将粪便标本放置在无菌容器内，-80 ℃条件下储存待检。

1.2仪器与试剂

1.2.1细菌培养及鉴定试剂环丝氨酸、头孢西丁、果糖琼脂选择培养基、肉汤、厌氧袋；甘油、无水乙醇、蒸馏水；0.5 mL、1.5 mL eppedorf(EP)管。

1.2.2仪器设备系统显微镜；梅里埃质谱仪、离心机、纯水器、-80 ℃、-20 ℃冰箱、CO2恒温培养箱、生物安全柜；振荡器、高温灭菌锅；超净工作台；凝胶成像系统分析仪；微量移液器，核酸电泳仪。

1.3方法

1.3.1细菌培养挑取约0.5 g粪便标本，将其置于EP管，等量添加无水乙醇，混合均匀，基于3 000 r/min展开离心处理，10 min后,弃去上清，取粪便标本沉淀物接种到环丝氨酸、头孢西丁、果糖琼脂培养基，在37 ℃条件下进行厌氧培养48 h后挑选出表面粗糙、凸起、灰白色、边缘不齐、有马粪味的可疑菌落，革兰染色，筛选后接种到血平板培养基，在37 ℃条件下厌氧培养、48 h进行分离纯化。使用飞行时间质谱仪对分离纯化后的细菌鉴定。

1.3.2菌株保存分离纯化得到的菌株洗脱到含20%甘油肉汤培养基中，-80 ℃冰箱储存备用。

1.3.3煮沸法提取DNA 艰难梭菌在血平板中进行接种，在37 ℃条件下进行厌氧培养48 h后，使用无菌棉签洗脱到含有1 mL的蒸馏水EP管中。在沸水中处理10 min，基于12 000 r/min展开离心处理，10 min后在上清液中提取细菌DNA，并储存于-20 ℃冰箱中。

1.3.4PCR检测艰难梭菌毒素基因检测艰难梭菌毒素基因tcdA、tcdB,扩增目的基因为1 265 bp及203 bp。检测艰难梭菌二元毒素cdtA、cdtB，扩增目的基因为375 bp及510 bp。PCR反应体系25 μL,依次加入0.2 μL上下游引物；缓冲液10×2.5 μL；dNTPs 2 μL；DNA模板2 μL；Tap酶1.5 μL；无菌ddH2O 18.45 μL。所有扩增产物展开1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为200 V、90 mA,10 min后将胶块放置在凝胶成像系统观察结果。

1.3.5多位点序列分型(MLST) 选取adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA、tpi7个管家基因进行PCR扩增，PCR反应体系50 μL，依次加入上下游引物各0.5 μL；缓冲液10×5 μL；dNTPs 4 μL；DNA模板3 μL；Tap酶0.25 μL；无菌ddH2O 36.75 μL。将PCR扩增产物送北京康普森生物技术有限公司进行双向测序。扩增位点序列与数据库(http://pubmlst.org/cdifficile)比对,在每个位点获得特异的等位基因数，形成对应的等位基因谱，确定相应的序列类型。

1.4统计学处理采用SPSS22.0统计学软件进行分析。计数资料组间比较采用χ2检验；计量资料中正态分布采用t检验，非正态分布采用秩和检验；CDI危险因素分析采用Logistic回归；P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1艰难梭菌菌株分离、毒素检测结果 67例粪便标本通过厌氧培养共获得10株艰难梭菌，艰难梭菌阳性率14.9%。产毒菌株共有10株，毒素A基因和毒素B基因全部为阳性的共8株，检出率为80.0%，1株为二元毒素基因阳性；10株中，2株仅有毒素B基因阳性，检出率为20.0%。

表1 患者基本资料分析

表2 CDI危险因素分析

2.2艰难梭菌MLST分型结果 MLST分型：共有5个ST型，5株ST2型，2株ST3型，1株ST102型，1株54型，1株201型。基因分型结果显示，本地区艰难梭菌基因型别较为分散，但是ST2型为主要的基因型别(50%)。

2.3CDI危险因素 67例患者中，CDI组12例，非艰难梭菌院内腹泻组(CDN组)55例。两组患者平均年龄分别为(59.1±15.05)岁和(64.67±13.8)岁，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。分析两组患者的危险因素表明，使用氟喹诺酮类抗菌药物是CDI的独立危险因素(OR值=3.12，P=0.036)，患者性别、基础疾病、胃肠道手术、侵入性检查、化疗药物、质子泵抑制剂的使用等均与CDI发生无关(P>0.05)。CDN、CDI两组患者血红细胞、血红蛋白、白细胞、清蛋白、血清肌酐、尿素氮等实验室检查结果比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

3 讨论

近年来，艰难梭菌已成为引起院内感染性腹泻和肠炎的主要病原体。由于抗菌药物滥用，造成肠道菌群紊乱，艰难梭菌大量增殖，同时释放毒素，导致感染性疾病的出现，其主要的表现就是肠道病理性损伤[10-11]。我国CDI患病率不断上升，2009年我国上海市一家医院研究发现中国住院患者CDI患病率仅为1.7/10 000住院患者。在一篇荟萃分析中显示，我国2009—2015年CDI引起的住院患者腹泻率是19%，高于欧美国家报道。本研究中CDI患病率是14.9%，与国外研究报道接近[12]。

CDI危险因素较多，可分为宿主因素如年龄、基础性疾病、长期住院、免疫抑制使用等和医源性因素如使用抗菌药物、胃肠道手术、使用质子泵抑制剂、肿瘤化疗等[13]。高龄、长时间住院和应用抗菌药物是CDI主要危险因素[13]。尽管本研究未发现高龄与CDI有关，但研究表明，艰难梭菌在老年人群中易受感染。相比于年龄<65岁的患者，患者年龄大于或等于65岁发生CDI的风险增加5～10倍，年龄大于或等于65岁不仅是CDI本身的重要危险因素，也是包括CDI严重程度和病死率在内不良临床结局的重要危险因素[8]。

住院患者艰难梭菌定植的比例因国家、患者年龄和住院时间的不同而不同[14-15]。本研究中未发现住院时间与CDI有关。研究发现在住院的第1天，艰难梭菌的患病率在2.1%～20.0%，并且随着住院时间的延长而增加，例如HUANG等[16]的一项研究表明，CDI患病率上升到20.0%～45.4%。PONNADA等[17]的一项研究表明，住院1个月后CDI患病率从2.1%增加到50.0%。在KHANNA等[18]的一项研究中，住院时间超过1个月CDI患病率在1%～50%。

几乎每一种抗菌药物都与CDI有关，包括用于治疗CDI的药物甲硝唑和万古霉素。与其他抗菌药物对比，碳青霉烯类、头孢菌素类、克林霉素及氟喹诺酮类抗菌药物诱发CDI的可能性要更高一些[19-20]。该研究发现氟喹诺酮类药物通常被认为是CDI的危险因素，优势比(OR值)为5.651 4[20]。降低住院患者氟喹诺酮类药物用量，4年内CDI患病率下降了17.45%[20]。在抗菌治疗期间和治疗4周后，发生CDI的风险是治疗前的8～10倍，在接下来的2个月会增加3倍[4]。正如BROWNE等[21]的一项研究，在过去30 d中，近期使用抗菌药物的患者CDI患病率高出2.41倍，抗菌药物使用的增加与抗菌药物相关性腹泻的流行具有一致性[12,21]。在本研究中仅发现氟喹诺酮类药物与CDI有关，因此抗菌药物使用在本次研究中未能全面体现出来。