贵阳部分医院产ESBLs肺炎克雷伯菌分子流行病学及相关耐药基因研究*

熊现秋,黄进友,侯 丽,陈秀英,应佳佳,闵少菊△

(1.贵州医科大学附属医院检验组，贵州贵阳 550001；2.贵州医科大学附属白云医院检验科，贵州贵阳 550001)

肺炎克雷伯菌是医源性感染的常见致病革兰阴性菌[1]。现在由于β-内酰胺类的抗菌药物大规模使用，使得耐药菌株的出现越来越多，其中主要的是产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的肺炎克雷伯菌[2-4]。在全球重要的医源性感染耐药中产ESBLs肺炎克雷伯菌引起的耐药成为了当前重要问题，给临床的治疗和预防造成了很大阻力[5]。为了探讨贵阳地区肺炎克雷伯菌耐药性，指导临床合理用药，本研究收集了贵阳部分医院2015年4月至2018年7月样本培养所得的产ESBLs肺炎克雷伯菌118株进行分析，将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年4月至2018年7月贵州医科大学附属医院、贵州省肿瘤医院、贵州医科大学附属白云医院成年住院患者产ESBLs肺炎克雷伯100株，产ESBLs肺炎克雷伯的诊断标准参照临床实验室标准化(CLSI)M100S标准执行。阳性对照选择ATCC700603肺炎克雷伯菌，阴性对照选择ATCC 25922肺炎克雷伯菌。

1.2仪器与试剂 用法国生物梅里埃VITEK2-compact细菌鉴定仪及配套卡片作细菌鉴定。M-H琼脂糖培养基购自法国法国生物梅里埃公司，药敏实验采用经典纸片扩散法(K-B法)。整个实验过程完全按照操作规程执行。

1.3耐药基因检测 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为50 μL：0.25 μL TaqExDNA聚合酶、5 μL 的10×PCR Buffer、4 μL 的dNTP混合物、2 μL的质粒DNA模板、3 μL相应引物见表1，各15 pmol/L、32.75 μL的无菌去离子水。TaqExDNA聚合酶、PCR Buffer、dNTP由购 自 TaKaRa公司。扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃解链25 s。64 ℃退火30 s，75 ℃延伸30 s，进行30个循环扩增。PCR扩增仪为Bio-Rad公司产品。测序法(IlluminaHiSeq 2000,上海宝腾生物技术有限公司完成)对部分阳性产物进行测序，结果与基因库颁布的序列进行比较。

表1 PCR扩增引物序列及长度

2 结 果

2.1药敏试验结果 氨苄西林在22种抗菌药物中耐药性比例最高，其次为哌拉西林和头孢唑啉，比例分别为95.2%、64.7%和63.3%；耐药率最低的是碳青霉烯类抗菌药物，美罗培南和亚胺培南分别为2.9%和4.0%。见表2。

2.2产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药性 产ESBLs的肺炎克雷伯菌在118株中有52株，比例为44.1%。除亚胺培南与美罗培南外，产ESBLs株对其余20种抗菌药物的耐药率均大于95%。

2.3耐药基因检测结果 118株菌中有6株未扩增出ESBLs基因型，其余均扩增出了相应的基因。仅携带1种基因型的分别为TEM型3株(2.5%)，SHV型5株(4.2%)，CTX-M型33株(28.0%)，KPC型6株(5.1%)。其中52.5%的菌株同时携带两种以上ESBLs基因型，10.1%的菌株同时携带3种以上基因型，且多为TEM型与CTX-M型或与SHV型基因共同存在。扩增基因产物见表3。对118株检出菌株检出基因型进行统计分析，两种基因同时检出的比例前三位分别为：TEM+CTX-M(9.3%)；TEM+SHV(8.5%)；TEM+KPC(7.6%)。同时检出3种基因的为：TEM+SHV+CTX-M(3.4%)；TEM+SHV+KPC(2.5%)；SHV+CTX-M+KPC(1.7%)。4种基因都检测出的有3株，检出率为2.5%。

表2 118株产ESBLs肺炎克雷伯菌对22种抗菌药物的耐药率(%)

表3 耐药基因各基因型阳性菌株检出比

2.4耐药基因测序结果 本研究取12株TEM亚组阳性菌株进行测序，基因型均为TEM-1；取18株CTX-M亚组阳性菌株进行测序，结果基因型为9株CTX-M-15，5株CTX-M-14，4株为CTX-M-24；15株SHV阳性菌株的基因型分别为SHV-1、2、11、12、27、61、99；取11株KPC亚组阳性菌株进行测序，结果8株基因型为KPC1，3株基因型为KPC2。

3 讨 论

细菌的耐药早已成为全球性问题，并在世界范围内流行。碳青霉烯类抗菌药物可以有效治疗肺炎克雷伯菌感染，但临床不合理应用抗菌药物使耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌数量逐年增加[6-9]。ESBLs水解β-内酰胺环，尤其是头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南等广谱抗菌药物，产ESBLs目前是革兰阴性菌耐药的主要原因之一[10-13]。

本文124株肺炎克雷伯菌药敏结果显示，耐药性较高的5种抗菌药物依次为氨苄西林、哌拉西林、头孢唑林和头孢呋辛钠。敏感率较高的5种抗菌药物依次为亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、庆大霉素和复方磺胺甲噁唑。本文中多重耐药菌占实验菌株的52.5%，可见肺炎克雷伯菌耐药非常严重。本研究显示，118株肺炎克雷伯菌有87株带有CTX-M型ESBLs，说明本地区成人肺炎克雷伯菌中ESBLs基因大多数携带有CTX-M型。CTX-M 系列酶其主要特征是对头孢噻肟水解能力较强，而对头孢他啶的水解能力很弱。CTX-M-15型和CTX-M-14型、CTX-M-24型是本地区成人肺炎克雷伯菌产ESBLs的流行型，与其他国内报道有所不同。同时本文结果可以看出本院产ESBLs肺炎克雷伯菌多基因携带情况较常见，多为CTX-M型与TEM型或SHV型基因同时存在，由此推断，产ESBLs肺炎克雷伯菌携带多种耐药基因，是造成本院肺炎克雷伯菌多重耐药的主要原因。ESBLs的产生很大程度上是由于β-内酰胺类抗菌药物的滥用引起的[14-15]，ESBLs会使医院感染变得复杂化，正确使用抗菌药物有助于控制其播散与爆发流行,要控制产ESBLs细菌的流行，不能光靠治疗，首先要做到正确合理的使用抗菌药物。根据目前所有研究报道碳青霉烯类抗菌药物(亚胺培南、美罗培南)ESBLs最有效，可作为首选药物，本研究结果也证实了这一结论，因此可以指导产ESBLs肺炎克雷伯菌的精准用药。作为医护人员尤其是检验人员，应加强防范意识，严格执行消毒隔离制度，加强对细菌及耐药的检测，并随时将耐药动态通报临床，指导临床合理使用抗菌药物，控制产ESBIS菌株的播散，以延缓细菌耐药的产生，从而达到减少发病、降低发病率、减少耐药菌传播的目的[16]。

4 结 论

成人产ESBLs的肺炎克雷伯菌耐药严重，本地区成人肺炎克雷伯菌中ESBLs基因大多数携带有CTX-M型，其中CTX-M-15型、CTX-M-14型、CTX-M-24型是本地区成人肺炎克雷伯菌产ESBLs的流行型。同时产ESBLs肺炎克雷伯菌多基因携带情况较常见，多为CTX-M型与TEM型或SHV型基因同时存在。